2多糖的提取和分离

一、脱脂动物、植物、微生物胞内多糖、其细胞组织外大多有脂质包围，要使多糖释放出来，首先需要脱脂。方法：将原材料粉碎，捣烂，加入甲醇或乙醇∶乙醚（v∶v=1∶1）混合液，水浴加热搅拌1-3小时，过滤。二、提取（残渣）1、水提：冷水、热水、沸水（评价指标：）提取温度：50、60、70℃提取时间：2、4、6Hr提取次数：1、2、3加水量：6-10倍体积第2章多糖的提取和分离水提醇沉法提取多糖是多糖提取中最常用的一种方法。其原理是利用多糖溶于水(热水)后，遇乙醇能沉淀通常的流程是将要提取的物质根据需要,加一定量的水后在合适的温度下进行水提（水浴），过滤，重复提取3次或3次以上，合并滤液，在旋转蒸发器中浓缩，离心去滤渣，然后向上清液中加三倍体积的95%的乙醇，醇沉过夜，离心收集沉淀。还可以根据具体情况进行正交实验来优选出适合的水料比以及乙醇浓度等。第2章多糖的提取和分离正交：（浓缩倍数）乙醇用量：60%；70%；80%；90%醇沉时间：3、6、12、24hr醇沉温度：5℃；10℃；20℃；30℃离心速度：4000、6000、8000、10000（评价指标：出膏率、多糖提取率、综合评分）第2章多糖的提取和分离计算:1、多糖提取率（％）＝提取物中多糖含量÷药材中多糖含量×1002、出膏率（％）＝水提物干重÷药材重×100。3、综合评分：根据实际情况，将多糖提取率和出膏率的权重系数分别定为0.6和0.4，采用综合评分法评价实验结果，综合评分＝多糖提取率×60％＋（100－出膏率）×40％4、多糖含量(%)＝标准曲线上查出样品含糖量×样品稀释总体积÷样品重×100％第2章多糖的提取和分离旋转蒸发器（浓缩）工作原理是：在旋转蒸发浓缩提取液时，通过真空泵抽真空，使水的沸点降低从提取液中蒸发出来，这样可以在较低的温度下达到浓缩的目的，使多糖成分不至于受破坏。第2章多糖的提取和分离2、稀酸：1%醋酸3、稀碱：0.1-1N氢氧化钠（钾）；几丁质的提取（5%氢氧化钠去杂）注意问题：防止降解（1）用稀酸提取时间宜短，温度最好不高于5℃。（2）用稀碱提取时，常通氮气或加入硼氢化钠（钾）。（3）稀酸、碱提取后要迅速中和、浓缩、透析与醇析。第2章多糖的提取和分离4、超声波：超声波是频率高于20kHz的机械波，它在媒质中传播时可产生空化现象，空化中产生的极大压力造成被破碎物在瞬间破碎，另外超声波的次级效应，如机械振动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速欲提取成分的扩散释放并充分与溶剂混合，利于提取。与常规提取法相比，具有提取时间短、产率高、无需加热等优点。因此，在提取细胞内物质的过程中可用超声波进行细胞破壁。第2章多糖的提取和分离超声提取技术能避免高温高压对有效成分的破坏，但它对容器壁的厚薄及容器放置位置要求较高，否则会影响药材浸出效果。而且目前实验研究都是处于很小规模，要用于大规模生产，还有待于进一步解决有关工程设备的放大问题。第2章多糖的提取和分离5、酶法：酶反应较温和地将植物组织分解，可以较大幅度提高收率，故酶解不失为一种最大限度从植物体内提取有效成分的方法之一。这是一项很有前途的新技术酶水解提取法常用于除去各种与多糖结合的蛋白质第2章多糖的提取和分离福建师范大学林宇野采用酶法提取银耳多糖：将银耳浆液pH调到6.3，加入1%复合酶制剂（果胶酶、纤维素酶、中性蛋白酶食品级复合酶）50℃下酶促反应40分钟，迅速升温至80℃灭活，并保温浸提1.5小时，浓缩、透析、醇沉、真空干燥。第2章多糖的提取和分离6、中性盐溶液提取法多糖提取主要采用热水抽提后用乙醇沉淀的方法，效果较好。但用中性盐提取可节约成本，中性盐溶液提取法给多糖提取提供了一种选择。在香菇、草菇的子实体加入0.1NNaOH溶液浸泡、冷冻、解冻并加热蒸煮后（约1h),分别收集滤液经浓缩、离心后将上清液分为均等的三份，分别加入70%、80%和90%饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀处理，并与95%乙醇提取的效果进行对比，70%饱和度的硫酸铵盐析与等量的95%的乙醇效果相当，80%饱和度的优于等量的95%乙醇。第2章多糖的提取和分离植物多糖多糖可存在于植物的根、茎、叶、花、果及种子中。大部分植物多糖不溶于冷水，在热水中呈粘液状，在乙醇中能沉淀。这样从植物中分离、提取单一的植物多糖并鉴定其纯度则及为困难。故提取时需注意对一些含脂较高的根、茎、叶、花、果及种子类在用水提取前应先脱脂。而对含色素较高的根、茎、叶、果实类应进行脱色处理。第2章多糖的提取和分离天麻多糖的制取：工艺:原料→粉碎→输送→储罐→浸出罐→压滤→预处理→分离纯化→超滤→冷冻干燥→装胶囊→产品包装→成品入库.天麻多糖GEP-1、GEP-2、及GEP-3。第2章多糖的提取和分离1、细胞内贮存多糖的提取和分离当归水溶性多糖的提取和分离2、果胶类物质的提取和分离（1）单子叶植物细胞壁中鼠李-半乳糖醛酸聚糖的分离（2）双子叶植物细胞壁中鼠李-半乳糖醛酸聚糖的分离3、半纤维素的提取和分离（1）悬浮培养细胞半纤维素的分离（2）新鲜植物组织半纤维素的分离4、树胶和粘胶多糖（1）根部多糖的分离（2）茎部多糖的分离（3）皮部多糖的分离（4）叶中多糖的分离（5）花中多糖的分离（6）大蒜球根部多糖的提取5、寡糖素（寡糖半乳糖醛酸）的酶法制备、纯化和活性测定第2章多糖的提取和分离微生物多糖各种真菌中所含多糖类化合物，其提取分离方法也利用水提醇沉。除去小分子杂质和蛋白质（Sevage法、三氟二氯乙烷法等）即可得多糖习惯把微生物多糖分为三种类型：细胞壁多糖:位于细胞壁层；细胞内多糖:位于原生质膜内侧或作为原生质膜的组分；细胞外多糖:位于细胞壁外。第2章多糖的提取和分离1、蜜环菌细胞壁壳聚糖的制备(1)甲壳素的制备工艺：采用以下工艺提取甲壳素螯虾壳菌体洗净，烘干，称重，粉碎洗净，烘干加10%HCl浸泡一天称重，粉碎加10%NaOH(NaOH:菌重=20:1ml/g)沸水浴6h,水洗至中性加0.5%KmnO4浸泡30min,水洗除去剩余KmnO4加1%草酸70℃水浴1h,水洗至中性,上冷冻干燥机得到甲壳素粗品第2章多糖的提取和分离1、蜜环菌细胞壁壳聚糖的制备(2)壳聚糖的制备：称取甲壳素粗品与45%的NaOH溶液一起在灭菌锅中加热（压力1.2-1.4Kgf/cm2,温度为121—126℃）脱乙酰基3小时，用热水洗至中性。然后，将产品用4%盐酸抽提（酸抽提两次），过滤除去不溶物。再用10%的NaOH溶液调pH至pH=10析出沉淀物，过滤洗涤至中性，冷冻干燥得壳聚糖产品。第2章多糖的提取和分离2、蜜环菌胞内多糖的提取取新鲜菌丝体，均浆，在70℃水浴中提取，滤液浓缩后，经DEAE-纤维素柱色谱（cl-1型）分离，依次用H2O、Nacl0.5mol/L洗脱，用苯酚-硫酸法检测，分离得到AMG-1，AMG-2；以AMG-1为对象进行系统研究，分别将AMG-1和AMG-2透析脱去小分子物质（分子量＜8000Da后，再经SephadexG-75纯化得AMG-1A和AMG-1B；AMG-2A、AMG-2B和AMG-2C等。3、蜜环菌胞外多糖的提取蜜环菌液态发酵培养物经过滤、离心，取上清液经浓缩、醇沉、冻干后，上柱分离。第2章多糖的提取和分离动物多糖动物中所含多糖多是酸性多糖，主要存在于动物的结缔组织中，常与蛋白质牢固的结合在一起，因此目前常用如下三种方法提取分离，即碱提取法、中性盐提取法和蛋白酶水解法。其中以酶解法较好，因其具有产物降解少且产量高的特点。第2章多糖的提取和分离三、去杂（小分子杂质）1、透析法透析是应用得最早的膜分离技术。透析的优点是用于分离两类分子量差别较大的物质，即将分子量103级以上的大分子物质与分子量在103级以下的小分子物质分离。由于是分子水平的分离，故无相的改变。透析法都是在常压下依靠小分子物质的扩散运动来完成的。第2章多糖的提取和分离透析法多用于去除大分子溶液中的小分子物质，此称为脱盐，其次常用来对溶液中小分子或分子进行缓慢的改变，这就是所谓的透析平衡，如透析结晶等。透析膜两边都是液体一边是供试样品液，主要成分是生物大分子，是试验过程中需要留下的部分，被称作“保留液”；另一边是“纯净”溶剂，即水或缓冲液，是供经薄膜扩散出来的小分子物质逗留的空间场所，或是提供平衡小分子物质的“仓库”，透析完成后往往是不要的，被称作“渗出液”。第2章多糖的提取和分离透析膜：可以充当透析膜的材料很多，如禽类嗉囊、兽类的膀胱、羊皮纸、玻璃纸、硝酸纤维薄膜等。用于制作透析膜的高聚物应具有以下特点：（1）在使用的溶剂介质中能形成具有一定孔径的小分子筛样薄膜。由于介质一般为水，所以膜材料应具有亲水性，它只允许小分子溶质通过而阻止大分子通过。（2）在化学上呈惰性。不具有与溶质、溶剂起作用的基团，在分离介质中能抵抗盐、稀酸、稀碱或某些有机溶剂，而不发生化学变化或溶解现象。（3）有良好的物理性能。包括一定的强度和柔韧性，不易破裂，有良好的再生性能，便于多次重复使用。第2章多糖的提取和分离三、去杂（小分子杂质）2、超滤超滤的特征和用途是一项分子级薄膜分离手段，它以特殊的超滤膜为分离介质，以膜两侧的压力差为推动力，将不同分子量的物质进行选择性分离。可用来分离蛋白质、酶、核酸、多糖、多肽、抗生素、病毒等。第2章多糖的提取和分离常被用作：（1）大分子物质的脱盐和浓缩，以及大分子溶剂系统的交换平衡；（2）小分子物质的纯化；（3）大分子物质的分级分离；（4）生化制剂或其它制剂的去热源处理。超滤技术是制药工业、食品工业、电子工业以及环保护理诸领域中不可缺少的有力工具。第2章多糖的提取和分离超滤膜超滤膜的构造：由“功能层”（皮肤层）和“海绵层”（支持层）构成的各向异性膜。功能层是具有一定孔径的多孔层，厚度0.1-1μm；海绵层是孔隙大得多的，厚度约1mm厚的层，增大机械强度。这种膜不易堵塞，流速要比各同性膜快数十倍。目前所用的超滤膜基本上都是各向异性扩散膜。第2章多糖的提取和分离超滤膜的选用（1）截流分子量（2）流动速率（3）其它：操作温度：不同的膜基材料对温度的耐受能力差异很大。化学耐受性：不同型号的超滤膜与各种溶剂或药物的作用也存在很大差异。膜的吸附性质：希望它对溶质的吸附尽可能少些。第2章多糖的提取和分离膜的无菌处理：许多生化物质及生化药物需要在无菌条件下进行处理，所以必须对超滤器及超滤膜实行无菌化。常用超滤装置：板式、管式、中空纤维式等。影响超滤的因素：溶质的分子特性（分子量、分子形状、电荷、溶解度等）、膜的性质（孔径、结构、电荷等）以及膜装置和超滤运转条件（膜或组合膜的构造、超滤器的结构以及操作压力，搅拌情况和液体物料的温度、粘度、pH、离子强度等）等因素决定。第2章多糖的提取和分离四、脱色、脱蛋白植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，这些色素大部分呈负性离子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树脂DEAE纤维素第2章多糖的提取和分离（一）脱色1、活性碳等吸附剂活性炭具有吸附能力强、价格低廉、来源方便等优点，但不同批号或不同来源的活性炭，吸附能力常常有差异，此外，易影响环境卫生。一般情况下，尽量避免用活性炭来处理，因为活性炭会吸附多糖。（1）活性炭的类型：粉末状活性炭、颗粒状活性炭、锦纶活性炭（以锦纶为粘合剂）。（2）应用活性炭时注意事项：活性炭的用量（一般用量在0.5%-3%(W/V)范围内）、适宜的温度、适当的pH值（一般碱性物在中性下吸附，在酸性下解吸；酸性物在中性下吸附，碱性解吸。）、吸附时间（在搅拌条件下，一般30-40分钟，但必须搅拌充分。）第2章多糖的提取和分离2、DEAE纤维素：植物来源的多糖，可能含有酚型化合物而颜色较深，这些色素大部分程负性离子，不能用活性炭吸收剂脱色，可用弱碱性树脂DEAE纤维素或DuoliteA-7来吸附色素。3、糖与色素结合型的：若糖与色素结合，易被DEAE纤维素修复，不能被水洗脱，这类色素可进行氧化脱色；以浓氨水或NaOH溶液调至pH8.0左右，50ºC以下滴加双氧水至浅黄色，保温2小时,可用H2O2脱色，但温度不能高于室温，否则在氧化色素的同时，多糖