铜离子胁迫对葡萄汁中酿酒酵母的影响

中国农业科学2010,43(15):3259-3265ScientiaAgriculturaSinicadoi:10.3864/j.issn.0578-1752.2010.15.026收稿日期：2010-03-26；接受日期：2010-05-14基金项目：北京市重点项目“葡萄酒庄及葡萄酒技术研发平台建设”（D07060501700703）作者简介：杜君，硕士。Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]。通信作者战吉宬，副教授，博士。Tel：[phone]；E-mail：[e-mail]铜离子胁迫对葡萄汁中酿酒酵母的影响杜君，李海兰，李慧，战吉宬，黄卫东（中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）摘要：【目的】明确铜离子胁迫对模拟葡萄汁培养基和真实酿酒葡萄汁培养基中酵母发酵行为的影响及其差异性。【方法】以模拟葡萄汁和赤霞珠葡萄汁为发酵培养基，分别添加CuSO4以设置0.05mmol·L-1和0.50mmol·L-1两个不同的Cu2+浓度，研究铜胁迫对两种培养基中酿酒酵母生长和发酵过程的影响。【结果】铜胁迫能够降低两种培养基中酵母的存活率。0.05mmol·L-1Cu2+严重抑制了模拟葡萄汁的发酵过程，其产生CO2和酒精的量分别为对照组的26.47%和30.76%，残糖量显著增多。而0.05mmol·L-1Cu2+对赤霞珠葡萄汁发酵过程基本没有影响。0.50mmol·L-1Cu2+几乎完全抑制了模拟葡萄汁的发酵过程，只是在一定程度上影响了赤霞珠葡萄汁发酵过程中CO2、酒精的产量以及对还原糖的利用率，但与对照组没有显著差异。模拟葡萄汁发酵后发酵液中Cu2+浓度与发酵前无显著差异，赤霞珠葡萄汁发酵后发酵液中Cu2+浓度显著低于发酵前。【结论】铜胁迫不但影响酵母的存活率，而且可显著影响酵母对还原糖的利用性能，进而影响CO2和酒精的产量。酿酒酵母在赤霞珠葡萄汁中比模拟葡萄汁中能够耐受更高浓度的铜胁迫，原因之一可能在于赤霞珠葡萄汁中的皮渣能够通过吸附降低发酵液中Cu2+浓度。关键词：铜；模拟葡萄汁；赤霞珠葡萄汁；发酵InfluenceofCopperStressonSaccharomycescerevisiaeGrapeMustDUJun,LIHai-lan,LIHui,ZHANJi-cheng,HUANGWei-dong(CollegeofFoodScienceandNutritionalEngineering,ChinaAgriculturalUniversity,Beijing100083)Abstract:【Objective】Theresearchaimedtoclarifythemechanismanddifferencesofthefermentationbehaviourbetweenthemodelsyntheticmedium(MSM)andCabernetSauvignongrapemustundercopperstress.【Method】Inthepresentwork,theinfluenceofCu2+stressonSaccharomycescerevisiaeactivityandthefermentationprocesseswerestudiedintheMSMandCabernetSauvignongrapefermentationmust.CuSO4wasaddedintothemediumtoachieve0.05mmol·L-1and0.50mmol·L-1Cu2+concentrations.【Result】Cu2+stressdecreasedtheyeastviabilityinthetwofermentationmediums.FortheMSM,thefermentationofSaccharomycescerevisiaewasseverelyinhibitedinthepresenceof0.05mmol·L-1Cu2+.TheyieldsofCO2andethanolwere,respectively,26.47%and30.76%ofthecontrolandalsotheutilizationofreducedsugardecreasedapparently.While0.05mmol·L-1Cu2+stresshadlittleeffectsonCabernetSauvignongrapemustfermentation.ThefermentationofMSMwastotallyinhibitedunder0.50mmol·L-1Cu2+stress.IntheCabernetSauvignongrapemustfermentation,onlyminoreffectswereobservedinthepresenceof0.50mmol·L-1Cu2+,whichhadnostatisticallysignificantdifferencescomparedtothecontrol.TherewasnodifferenceofcopperconcentrationinMSMbeforeandafterfermentation,whilethecopperconcentrationinCabernetSauvignongrapemustwassignificantlydecreasedafterfermentation.【Conclusion】Copperstresscoulddecreasetheyeastviabilityandinhibittheutilizationofreducingsugar,thusresultedinthedecreasedyieldofCO2andethanolapparently.TheyeastinCabernetSauvignongrapemusthadhigherresistancetoCu2+thanthatinMSM.OnereasonmaybecontributedtotheabsorptionofCu2+bythegraperesidue.Keywords:copper;modelsyntheticmedium;CabernetSauvignongrapemust;fermentation3260中国农业科学43卷0引言【研究意义】铜是有机体必需的一种金属元素，少量的铜对生物体有积极的作用。作为超氧化物歧化酶（SOD）的重要辅基，铜对清除氧自由基，保护细胞有重要作用；铜还是维持呼吸的细胞色素氧化酶的重要辅基[1]。但是在高浓度情况下，铜也可与硫醇基团结合，或者催化Fenton反应[2]，产生·OH[3]，引起细胞伤害[4]。为了防治葡萄霜霉病等葡萄病害，很多含铜的杀菌剂，如波尔多液[CuSO4+Ca(OH)2]等在葡萄园中广泛使用。部分铜会随果穗、土壤、叶片等进入发酵液中[5]。欧盟规定铜在葡萄酒发酵过程中的含量应该控制在0.078mmol·L-1内。Garcia-Esparza等[6]研究发现，约13%的葡萄和18%的葡萄酒中含铜量远远超过了最大残留量。因此研究不同浓度Cu2+对发酵过程的影响具有重要意义。【前人研究进展】关于Cu2+对酵母及酒精发酵的影响研究，主要集中在Cu2+对酵母的生长活性和对主要代谢产物酒精生成量的影响研究。一般都认为Cu2+会抑制酵母的正常生长，延迟酒精发酵[7]。关于酒精生成量则有不同的报道。多数报道显示酒精生成量减少，但也有酒精生成量增加的报道[8]。Cu2+对发酵的影响可能与菌株类型、Cu2+设置浓度或酵母的生长环境有关。如酿酒酵母的抗铜性能与菌株本身的特性相关密切。有研究者分别采用铜敏感酵母和抗铜酵母进行试验，发现发酵液中含有少量的Cu2+即能明显地影响铜敏感酵母的活性，而抗铜酵母的生长活性不受影响。在高Cu2+浓度的发酵液中，抗铜酵母能够显著降低Cu2+浓度，并积累在酵母细胞内[9-10]，但是没有研究Cu2+被酵母细胞吸附后的发酵过程是否产生变化。【本研究切入点】模拟葡萄汁可以方便地进行成分调整以满足研究需要，而且不受葡萄成熟时间的限制，常被试验采用作为发酵培养基。但是它比实际的酿酒葡萄发酵液的成分简单得多。因此用于指导生产有一定的局限性。【拟解决的关键问题】本试验以作者所在实验室自选菌株SaccharomycescerevisiaeBH8为试验菌株，拟通过研究不同Cu2+浓度对模拟葡萄汁和赤霞珠葡萄汁（带皮）发酵过程影响的区别，确定Cu2+胁迫对模拟培养基和真实酿酒葡萄汁培养基中酵母发酵行为的影响机制及其差异性，以用于指导实际生产。1材料与方法1.1试验菌种及培养基SaccharomycescerevisiaeBH8，葡萄酒酵母，为本实验室分离菌种。种子培养基（g·L-1）：酵母粉（10），蛋白胨（20），葡萄糖（20）。接种一环斜面上保藏的菌种到60mL种子培养基中。28℃摇床培养15h至对数中后期，转速为120r/min。模拟葡萄汁发酵培养基：模拟葡萄汁的配制参考Marullo等[11]的方法。该培养基也曾被Masneuf-Pomarède等[12]采用以模拟葡萄汁的成分。赤霞珠葡萄汁发酵培养基：赤霞珠酿酒葡萄于2009年9月11日采自河北省怀来县。去梗后经小型压榨机适度破碎而成[13]。总糖（g·L-1）:194.38，总酸（以酒石酸计，g·L-1）:8.31，pH3.54。1.2Cu2+胁迫浓度设置Cu2+浓度设置范围参考Manuel在白葡萄汁发酵试验的设置[14]。初始时，在两种发酵培养基中加入不同量的CuSO4，以达到0、0.05mmol·L-1和0.50mmol·L-1Cu2+浓度。1.3酿酒酵母存活率的测定取种子培养基中培养到对数中后期的酵母菌液分别接种到两种不同的发酵培养基（1%的接种量），使之初始菌液OD600为0.02左右，然后于28oC培养箱中静置培养。于不同发酵时间，在超净工作台上从发酵培养基中取样。酿酒酵母存活率的测定采用0.1%美蓝染色法[15]进行。根据酵母的具体生长情况，稀释菌液至合适倍数。然后取100μL稀释菌液至含有100μL0.1%美蓝染色液的微量离心管中，用移液枪重悬混合均匀。取100μL菌悬液至血球计数板中，在电子显微镜下，40×观察并计数。1.4酿酒酵母发酵性能的测定试验以二氧化碳的产生量来表示酿酒酵母的发酵性能。取种子培养基中培养到对数中后期的酵母菌液分别接种到两种不同的发酵培养基（1%的接种量），使之初始菌液OD600为0.02左右。发酵栓中加入6—8mL浓硫酸，称重，然后于28℃培养箱静置培养。每隔24h在电子天平上称重并记录。连续3d重量差值低于0.02g时，发酵视为结束。1.5还原糖和酒精的测定方法取种子培养基中培养到对数中后期的酵母菌液分别接种到两种不同的发酵培养基（1%的接种量），使之初始菌液OD600为0.02左右，然后于28℃培养箱中静置培养。于不同发酵时间，在超净工作台上从发酵15期杜君等：铜离子胁迫对葡萄汁中酿酒酵母的影响3261培养基中取样。使用高效液相色谱仪（Waters2695，Milford，MA，美国），色谱柱为AminexHPX-87H（300mm×7.8mm，Bio-Rad，美国）；柱温65℃；检测器为示差检测器。流动相为0.005mol·L-1H2SO4，流速为0.6mL·min-1，进样量为10µL[16]。1.6Cu2+的测定方法两种发酵培养基在发酵初始和发酵结束时分别取样测定Cu2+浓度。Cu2+浓度按照GB/T15038—2006（二乙基二硫代氨基甲酸钠比色法）测定。1.7数据分析每个试验结果取3次重复的平均值，数据统计分析采取ANOVA分析方法，显著水平是0.05。2结果2.1铜胁迫下两种培养基发酵过程中葡萄酒酿酒酵母存活率的影响试验结果表明，无论模拟葡萄汁（图1）还是赤霞珠葡萄汁（图2），Cu2