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429572439gao课题3酵母细胞的固定化授课教师：张建华一、课题背景阅读课题背景并思考：1、直接使用酶制剂在应用中各有什么优、缺点？如何解决使用酶制剂时的缺陷？2、固定化酶技术在应用中各有什么优、缺点？如何解决使用固定化酶技术在应用时的缺陷？3、固定化细胞在应用中各有什么优、缺点？1、直接使用酶制剂①天然酶通常对强酸、强碱、高温和有机溶剂等条件非常敏感，容易失活②溶液中酶很难回收，不能再次利用，提高了生产成本③反应后，酶会混在产物中，影响产品质量，难以在工业生产中广泛应用（1）优点（2）缺点催化效率高、低耗能、低污染，大规模地应用于食品、化工等各个领域如何解决这些问题？1、直接使用酶制剂（3）解决方案固定化酶技术2、固定化酶（1）含义：将酶固定在不溶于水的载体上。（3）优点：酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。（4）缺点：一种酶只能催化一种化学反应，而在实际生产中，很多产物的形成是通过一系列的酶促反应才能得到。（5）解决方案：固定化细胞技术（2）实例：利用固定化酶技术生产“高果糖浆”。固定化酶的应用实例：生产高果糖浆1、什么是高果糖浆？使用它有何好处？高果糖浆是果糖含量为42%左右的糖浆。作为蔗糖的替代品，高果糖浆不会像蔗糖那样诱发肥胖、糖尿病、龋齿和心血管病，对人的健康有利。再思考：果糖属于什么糖?果糖是一种：单糖分子式：C6H12O62、生产高果糖浆需要什么酶？其作用是什么？这种酶有何特点？直接使用酶时有什么缺点？生产高果糖浆需要：作用：特点：直接使用酶时的缺点：葡萄糖异构酶酶稳定性好，可持续发挥作用将葡萄糖转化为果糖酶溶于葡萄糖溶液后，就无法从糖浆中回收，造成很大的浪费。如何改进？3、改进：固定化酶技术4、具体做法：5、优点：①反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本。②提高了果糖的产量和品质。3、固定化细胞（1）含义：将细胞固定在一定空间内的技术。（2）优点：成本低、操作容易、对酶活性的影响更小、可以催化一系列的反应、容易回收（3）缺点：固定后的细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降，由于大分子物质难以自由通过细胞膜，因此固定化细胞的应用也受到限制。但相对较为完善。二、酶和细胞固定化方法(看课本P50）思考：固定化酶或固定化细胞指什么？可以采取哪些方法进行固定？各有什么利弊？①物理吸附法②包埋法③化学结合法1、固定化酶或固定化细胞：指利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。2、方法：将酶（或细胞）包埋在细微网格里将酶（或细胞）相互结合，或将其结合到载体上。将酶（或细胞）吸附在载体表面上包埋法化学结合法物理吸附法固定化酶或固定化细胞采取的方法〖思考1〗对固定酶的作用影响较小的固定方法是什么？〖思考2〗将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当固定（酶、细胞）。吸附法。三、实验操作：包埋法固定细胞明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。1、包埋法固定细胞：即将微生物细胞均匀地包埋在不溶于水的多孔性载体中。2、包埋时常用的载体包括：海藻酸钠：一种天然多糖，是由海带中提取的天然多糖碳水化合物，可作为食用的食品添加剂，也可作为支架材料用于医学用途，其温和的溶胶凝胶过程、良好的生物相容性使其适于作为释放或包埋药物。三、实验操作（一）制备固定化酵母细胞（二）用固定化酵母细胞发酵（一）制备固定化酵母细胞1、酵母细胞的活化：在缺水状态下，微生物处于休眠状态。活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。1g干酵母＋10mL蒸馏水→50mL烧杯→搅拌均匀→放置1h，使之活化。〖思考〗活化是指什么？酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。2、配制物质的量浓度为0.05mol/L的CaCl2溶液：0.83gCaCl2＋150mL蒸馏水→200mL烧杯→溶解备用。〖思考〗为什么要用蒸馏水，而不用自来水？防止自来水中各种离子影响实验结果溶解物质要彻底。3、配制海藻酸钠溶液0.7g海藻酸钠＋10mL水→50mL烧杯→酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化→蒸馏水定容到10mL。加热时要用小火，或者间断加热，并搅拌，反复几次，直到海藻酸钠溶化为止〖思考〗为什么要用小火或间断加热，并不断搅拌？防止海藻酸钠发生焦糊。429572439gao4、海藻酸钠溶液和酵母细胞混合将溶化好的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入以活化的酵母细胞，进行充分搅拌，再转移至注射器中以免海藻酸钠温度过高杀死酵母菌〖思考〗为什么要将海藻酸钠冷却至室温？海藻酸钠溶液必须冷却至室温，搅拌要彻底充分，使两者混合均匀，以免影响实验结果的观察。429572439gao（5）固定化酵母细胞以恒定的速度缓慢的将注射器中的溶液滴加CaCl2溶液中，将形成的凝胶珠在CaCl2溶液中浸泡30min左右。〖思考〗CaCl2溶液有什么作用？使胶体聚沉，凝胶珠形成稳定的结构。刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。滴加注射器中的溶液时，速度一定要恒定且缓慢，以便形成的凝胶珠呈均匀的圆形或椭圆形。429572439gao（二）用固定化酵母细胞发酵①将固定化酵母细胞（凝胶珠）用蒸馏水冲洗2－3次。②将150ml质量分数为10％的葡萄糖溶液转移至200ml的锥形瓶中，再加入固定好的酵母细胞，置于25°C下发酵24h〖思考〗1、为什么要用蒸馏水冲洗凝胶珠？洗去凝胶珠表面多余的CaCl2溶液。以免对实验造成影响。〖思考〗2、葡萄糖在这里有什么用？既可以作为发酵底物，也作为酵母菌细胞的营养物质。429572439gao1、海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高：四、特别注意：将很难形成凝胶珠。高浓度海藻酸钠只能用粗针头注射，针头粗也会粘着，难促使形成液滴。且高浓度海藻酸钠不易形成滴状下落，形成条状，不是圆形或是椭圆形，品相极差，并且凝胶珠容易破裂。形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少。因为包埋不紧密，细胞容易从包埋材料中漏出。且形成的凝胶珠可能带细丝尾巴。如果浓度过低：刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的2、酵母细胞的固定化（一）观察凝胶珠的颜色和形状五、结果分析与评价（二）观察发酵的葡萄糖溶液如果制作的凝胶珠颜色过浅、呈白色：说明海藻酸钠的浓度偏低，固定的酵母细胞数目较少；如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形：说明海藻酸钠的浓度偏高。二者都说明制作失败，需要再作尝试。利用固定的酵母细胞发酵产生酒精，可以看到产生了很多气泡，同时会闻到酒味〖思考〗1、发酵过程中锥形瓶为什么要密封？酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。〖思考〗2、锥形瓶中的气泡和酒精是怎么形成的？酵母菌进行无氧呼吸产生的本节结束并做好复习！请完成习题