凝胶

注射用硫酸链霉素的细菌内毒素检查法本试验所选样品，不须经过特殊处理即可排除干扰，作者对操作过程及结果表达的文字处理仅供学习探讨，探讨本样品可以加强对细菌内毒素检查法的理解，也为最初参加本项工作的同志提供了参考依据。通过学习本样品可以达到以下目的：1、掌握新品种内毒素限值的确定。2、掌握细菌内毒素检查法——凝胶法的操作规程。3、掌握新品种干扰试验的设计。4、掌握试验结果分析。一、试剂和样品鲎试剂（批号：040330灵敏度：0.5EU/ml；批号：040317灵敏度：0.25EU/ml；规格均为0.1ml/支；湛江海洋生物制品厂生产）细菌内毒素检查用水（批号：031229规格：2ml/支；湛江海洋生物制品厂生产）细菌内毒素工作标准品（内毒素工作标准品2004-2，160EU/支，中国药品生物制品检定所提供）注射用硫酸链霉素（规格：1.0g/瓶批号：20020523生产厂家：大连美罗大药厂）二、干扰实验：（一）、限值的确定：由于2000版中国药典细菌内毒素检查法没有收载注射用硫酸链霉素品种的内毒素限值，按照2005年版中国药典细菌内毒素检查法内毒素限值的计算方法，在此我们通过计算并参考美国药典25版注射用硫酸链霉素规定的内毒素限值L=0.25EU/mg。L=K/M=5.0EU/kg.hr/1200mg/60kg.hr=0.25EU/mgM为人用每公斤体重每小时最大剂量，以《临床用药须知》和《化学药品说明书汇编》所载的临床剂量为准(M=1.2g)。补充说明：2005年版中国药典二部附录《细菌内毒素检查法》内毒素限值的建立药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU/ml、EU/mg或EU/U活性单位表示；K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/(kg·h)表示，注射剂K=5EU/(kg·h)，放射性药品注射剂K=2.5EU/(kg·h)，鞘内用注射剂K=0.2EU/(kg·h)；M为人用每公斤体重每小时最大剂量，以ml(kg·h)、mg(kg·h)或U活性单位/(kg·h)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若不足1小时，按1小时计算。（二）、干扰试验浓度的计算：按照中国药典2005年版提供的公式计算最大有效稀释倍数，选用鲎试剂的灵敏度λ为0.5EU/ml和0.25EU/ml，用4ml细菌内毒素检查用水将样品注射用硫酸链霉素溶解，则C=1000mg/4ml=250mg/ml。计算方法如下：MVD=CL/λ=250×0.25/0.25=250倍这里涉及到样品的浓度C，因不同检验操作人员可能选用不同体积的细菌内毒素检查用水溶解样品，这样每个检验操作人员的样品浓度C都不同，计算出的最大有效稀释倍数MVD也不同。对于粉末类药品，我们直接通过对内毒素限值表达方式的变换，就可以得到干扰试验用的药品浓度，而不必用MVD公式计算。L=0.25EU/mg=0.25EU/ml/1mg/ml=0.5EU/ml/2mg/ml=0.125EU/ml/0.5mg/ml=0.06EU/ml/0.25mg/ml(三)、预试验样品信息结果2mg/ml1mg/ml0.5mg/ml0.25mg/ml0.5EU/ml0.25EU/ml0.125EU/ml0.06EU/mlPPC++++++++PC++++++++NC--------样品管--------预试验结果，样品硫酸链霉素在2mg/ml~0.25mg/ml范围内不存在明显的增强和抑制作用，可选用其中任一浓度做该样品的细菌内毒素干扰试验。我们选用该样品的2mg/ml和1mg/ml溶液做演示试验。（四）、凝胶法干扰试验溶液的制备干扰试验溶液的制备见下表，各溶液制备方法如下：溶液名称WSE/配制内毒素的溶液稀释用液倍数WSE管数供试品无/供试品溶液———2Et2λ/供试品溶液供试品溶液12482λ1λ0.5λ0.25λ4444ES2λ/BETBET12482λ1λ0.5λ0.25λ4444NC无/BET———2补充：1、在哪种条件下要做灵敏度复核试验？答：当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。2、在哪种条件下要做干扰试验？答：当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验。当鲎试剂、供试品的来源、配方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。1、供试品溶液：注射用硫酸链霉素溶解稀释：用细菌内毒素检查用水(4ml)将其溶解并稀释到4.0mg/ml、2.0mg/ml和1.0mg/ml备用。操作过程必须严格遵守无菌操作规程，保证无外源物质的干扰。链霉素溶液（250mg/ml）链霉素溶液（20mg/ml）链霉素溶液（4.0mg/ml）链霉素溶液（2.0mg/ml）链霉素溶液（1.0mg/ml）4ml0.3ml3.45ml0.4ml1.0ml0.3ml1.6ml1.0ml0.3ml2、鲎试剂灵敏度的对照系列：根据鲎试剂灵敏度的标示值（λ），将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水1ml溶解，在旋涡混合器上混合15分钟，然后制备成1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml和0.06EU/ml等5个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒钟。200EU/ml20EU/ml2.0EU/ml1.0EU/ml0.5EU/ml0.125EU/ml0.25EU/ml0.06EU/ml0.2ml0.2ml1.8ml1.8ml1.2ml1.2ml1.2ml1.2ml0.3ml1.2ml1.2ml0.3ml1.2ml1.2ml补充：内毒素标准品的正确开启方法取细菌内毒素工作标准一支，轻弹瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻划痕，用75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶内。正确（易折点）错误3、干扰试验系列的制备方法：（1）、取注射用硫酸链霉素的4.0mg/ml稀释液分别加入四支试管中，每管加0.2ml，然后分别吸取相同体积的内毒素标准溶液，浓度依次为2.0EU/ml、1.0EU/ml、0.5EU/ml、和0.25EU/ml，加入四支试管中。将这四支管混合均匀即可得到含内毒素分别为1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml和0.125EU/ml，含样品注射用硫酸链霉素浓度为2.0mg/ml的标准内毒素对照溶液（干扰试验）。链霉素4.0mg/ml内毒素标准溶液0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml(2EU/ml)0.2ml(1EU/ml)0.2ml(0.5EU/ml)0.2ml(0.25EU/ml)1EU/ml/2.0mg/ml0.5EU/ml/2.0mg/ml0.25EU/ml/2.0mg/ml0.125EU/ml/2.0mg/ml（2）、取注射用硫酸链霉素的2.0mg/ml稀释液分别加入四支试管中，每管加0.2ml，然后分别吸取相同体积的内毒素标准溶液，浓度依次为1.0EU/ml、0.5EU/ml、0.25EU/ml、和0.125EU/ml，加入四支试管中。将这四支管混合均匀即可得到含内毒素分别为0.5EU/ml、0.25EU/ml、0.125EU/ml、和0.06EU/ml，含样品注射用硫酸链霉素浓度为1.0mg/ml的标准内毒素对照溶液（干扰试验系列）。链霉素2.0mg/ml0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml0.2ml(1EU/ml)0.2ml(0.5EU/ml)0.2ml(0.25EU/ml)0.2ml(0.125EU/ml)0.5EU/ml/1.0mg/ml0.25EU/ml/1.0mg/ml0.125EU/ml/1.0mg/ml0.06EU/ml/1.0mg/ml内毒素标准溶液（五）、干扰试验加样方法参考中国药典2005版细菌内毒素检查法。取含有分装了0.1ml鲎试剂溶液的10mm×75mm试管或复溶后的0.1ml/支规格的鲎试剂原安瓿18支，其中16管加入0.1ml内毒素标准溶液，每一个浓度平行做4管；另外2管加入0.1ml细菌内毒素检查用水作为阴性对照。将试管中溶液轻轻混匀后，封闭管口，垂直放入37℃±1℃适宜恒温器中，保温60分钟±2分钟。（六）、试验结果见下表：1、结果记录(TAL:040218，0.5EU/ml，样品浓度C为2.0mg/ml)WSE对照名称1.00.50.250.125NC结果ES++++++++----------0.5ET+++++++++---------0.52、结果记录(TAL:040225，0.25EU/ml，样品浓度C为1.0mg/ml)WSE对照名称0.50.250.1250.06NC结果ES++++++++----------0.25ET++++++++----------0.25补充：干扰试验判断的标准当Es在0.5λ—2.0λ(包括0.5λ和2.0λ)时，且当Et在0.5Es—2.0Es(包括0.5λ和2.0λ)时，则认为供试品在该浓度下无干扰作用。否则如果供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。3、结论依据中国药典2005版附录“细菌内毒素检查法”，注射用硫酸链霉素细菌内毒素检查干扰试验2.0mg/ml和1.0mg/ml的稀释液符合试验要求，对鲎试验没有干扰。三、样品常规检查建议用注射用硫酸链霉素溶液浓度C为1.0mg/ml，TAL（0.25EU/ml）。（一）、按表制备所需溶液注：A供试品溶液；B供试品阳性对照；C阳性对照；D阴性对照。编号内毒素浓度/配制内毒素的溶液平行管数A无/供试品溶液（1.0mg/ml）2B2λ（0.5EU/ml）/供试品溶液（1.0mg/ml）2C2λ（0.5EU/ml）/检查用水2D无/检查用水2首先，将样品注射用硫酸链霉素溶解稀释到2.0mg/ml和1.0mg/ml备用。1、供试品阳性对照PPC：（做2管）取注射用硫酸链霉素的2.0mg/ml稀释液和浓度为1.0EU/ml的内毒素稀释液各0.3ml混合均匀，取该混合液0.1ml加入已经复溶好的鲎试剂（λ=0.25EU/ml）中即可。2、阳性对照PC：（做2管）取0.1ml浓度为0.5EU/ml的内毒素稀释液加入已经复溶好的鲎试剂（λ=0.25EU/ml）中即可。3、供试品溶液：（做2管）取0.1ml注射用硫酸链霉素的1.0mg/ml稀释液加入已经复溶好的鲎试剂（λ=0.25EU/ml）中即可。4、阴性对照：（做2管）取0.1ml细菌内毒素检查用水加入已经复溶好的鲎试剂（λ=0.25EU/ml）中即可。四、关于影响细菌内毒素检查法试验结果的原因分析1、器皿的洗涤（洁净程度、洗涤用水）2、鲎试剂灵敏度的差异3、细菌内毒素工作品效价的误差4、样品本身属性的影响1）、β-葡聚糖2）、PH值3）、金属离子和弱酸阴离子5、实验操作的误差6、温度1、器皿洗涤的重要性《中国生物制品操作规程》389页——细菌内毒素检查法“玻璃器皿的洗涤”规定：“将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并烘干水分后，置洗液中浸泡4小时，取出将洗液沥干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性内毒素。”应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器皿必须“用新鲜蒸馏水冲洗，禁用纯化水和久置的蒸馏水冲洗。”有的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是由于纯化水和蒸馏水的内在质量不同所造成的。因纯化水中存在的阴阳离子经250℃高温干烤不能完全被破坏，这时不同的离子就产生对鲎试剂酶反应抑制或增强的反应，为了保证试验结果的准确性和检验报告的权威性，我们应该严格遵守操作规程，用新鲜多效蒸馏水冲洗鲎试验用玻璃器皿。移液管浸泡洗液时，应如何放置？A、正B、反反放（尖端向上）的优点？1、保护移液管刻度的