菌种鉴定流程

1药品微生物限度检查——控制菌检查2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室2菌种分离鉴定流程增菌分纯初步鉴别试验革兰染色生化试验酶类试验抗生素敏感性试验（用于菌种鉴定）全面鉴定血清分型毒素分析基因分型蛋白组分析自动化仪器分析（生化，酶学，基因序列等）2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室32参看药典微生物限度检查法有抑菌活性的检品应进行预处理稀释法离心沉淀集菌法3000r/min离心30min，有不溶性沉渣先500r/min离心5min薄膜过滤法0.45um±0.02100ml中和法磺胺类100ml中1~5ml1%对氨基苯甲酸；砷汞，硫乙醇酸盐；洗必泰，聚山梨醇酯80自然沉降法难溶于水的抗菌制剂同时做阳性和阴性对照了解常用的培养方法和常用培养基上各控制菌菌落特征，知道如何进行菌种分纯，以便于进行下面的试验2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室433.1操作步骤3.1.1制片-过火固定，避免水冲，破坏细胞结构使染料易透过3.1.2结晶紫染色-1分3.1.3碘液媒染-1分3.1.4乙醇脱色-30秒3.1.5沙黄复染-30秒2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室53.2染色结果革兰阳性菌呈蓝紫色；革兰阴性菌呈红色。可以分别用金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌作质控株2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室63.3革兰染色注意事项3.2.1玻片必须洁净3.2.2涂片菌量宜少，菌不可浓3.2.3新鲜培养物3.2.4脱色是关键2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室73.3革兰染色意义3.3.1初步识别细菌，利于进一步鉴定3.3.2初步选择治疗用药物3.3.3与致病性相关，阳性以外毒素为主，阴性菌以内毒素为主2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室84触酶试验触酶试验不应当在含血的碟子上（用上面的菌落试验应小心）进行因为红细胞中含有触酶可能导致假阳性出现用于检测细菌是否生成过氧化氢酶，是否利于在有氧环境中生长细菌在有环境中代谢可以生成超氧离子和过氧化氢，具有杀菌作用，能生成触酶的菌种容易耐氧。但厌氧菌有产生触酶者，某些非厌氧菌触酶也不产生（链球菌，此试验可用于菌种鉴别）2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室92005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室105氧化酶试验5.1试验方法：滤纸，无菌玻璃棒，1滴新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液5.2结果判定：30s，培养物出现粉红色逐渐变为紫红色，即为氧化酶试验阳性反应。若培养物不变色或仅显粉色为阴性反应2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室11试验阳性图示2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室125.35.3.1试验菌落(苔)必须新鲜，陈旧培养物反应不可靠5.3.2试验避免与铁、镍等金属接触，否则易出现假阳性。宜用玻璃棒或木棒5.3.3试剂宜新鲜配制，放置过久，二盐酸二甲基对苯二胺氧化变色不可用5.3.4反应需在有氧条件下进行，勿滴加试剂过多，以免浸泡培养物使之与空气隔绝，造成假阴性反应5.3.5含糖培养基上的菌落不适于做氧化酶试验，因为糖分解产酸抑制氧化酶活性2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室136血浆凝固酶试验简介主要用于金黄色葡萄球菌的鉴定分为两大类，结合凝固酶和游离凝固酶检测以试管法为参考方法2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室146凝固酶试验操作方法无菌试管(10×100mm)3支，加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液(1：1)各0.5ml，1支加入被检菌的营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml，作为检品管；其余2支作对照管：1支加入金黄色葡萄球菌［CMCC(B)26003］营养肉汤培养液或菌悬液0.5ml作为阳性对照；另一支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照三管同时置36±1℃水浴或恒温培养箱，3h后开始检查，以后每隔适当时间观察一次，直至24h2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室156凝固酶试验的注意事项血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维蛋白常已析出)易导致假阴性反应用试管法检查时，轻轻将试管倾斜，(动作勿大，防止江凝块摇碎)仔细观察试验时间过长容易导致假阴性2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室166凝固酶试验的结果判定阴性对照管血浆流动自如，阳性对照管液呈凝固状，试验管液呈凝固者为阳性反应；不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时，应另制备血浆，重新试验目前商品化的凝固酶试剂多家微生物相关制剂公司有售，试剂具有较好的稳定性、准确性2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室177生化试验细菌鉴定的传统方法，参考方法因为针对不同菌种，选择有针对性的生化试验进行，菌种不同所作的试验不同，药品检验中常用的种类不再一一介绍，所以在以后各菌种鉴定内容当中单独讨论所有试验都需要已知阳性和阴性的菌株作为质控菌株，定期对试剂、培养基（包括培养基的灵敏度试验）以及试验操作过程进行质控试验，保证结果解释的准确性2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室188自动化仪器优点：包含的菌种的生物学特性测试试验种类更多，可以提高菌种鉴定的准确率缩短菌种鉴定所需要的时间，为检品的快速检验提供保证细菌鉴定的酶学技术以及近红外技术等其他鉴定方法应用的研究将为药品微生物鉴定提供更多的选择和便利2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室19B-D公司的phenix系统、生物梅里埃公司的VITEK系统等2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室20生化鉴定2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室21一、大肠杆菌检查法2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室221大肠杆菌即大肠埃希菌（Escherichiacoli），为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外，还有蟑螂埃希菌等四个种大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌，随粪便排出体外。在药品中检出大肠杆菌，表明该样品受到人和温血动物的粪便污染，即可能污染肠道病原体。为保证人体健康，口服药品必须检查大肠杆菌大肠埃希菌除普通大肠杆菌外尚有致病性大肠杆菌、产毒性大肠杆菌、溶血性大肠杆菌、侵袭性大肠杆菌等，可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻、结膜炎等病症2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室232菌种为大肠杆菌［ＣＭＣＣ（Ｂ）44102］对照菌液加入量含菌50～100cfu（一般用量为0.1ml）制作方法：营养琼脂斜面培养物少许，接种至5ml营养肉汤培养基内，36±1℃培养18～24h后，用0.9％无菌氯化钠溶液稀释至1：106其用途：做阳性对照检查培养基灵敏度2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室2432005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室253.1增菌培养取胆盐乳糖（ＢＬ）培养基3瓶，每瓶各100ml2瓶分别加入规定量的供试液，其中1瓶加入含对照菌50～100个菌落形成单位的控制菌菌液作阳性对照，第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照37℃培养18～24h（必要时可延至48h）。阴性对照应无菌生长。摇匀上述BL增菌培养液2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室263.2MUG试验原理4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）试验的原理MUG被β-葡糖苷酸酶（GUD）水解，产生荧光实验证明96％的大肠杆菌含GUD，约10％的沙门菌属一些菌种也含有此酶。单一的MUG鉴别大肠杆菌其漏检率达6％，鉴于98％的大肠杆菌靛基质试验为阳性，故将MUG，靛基质试验结合，用EMB琼脂平板分离，辅以IMViC试验，在理论上可使大肠杆菌的检出率达99％由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍，易于观察，没有主观性，因而用MUG鉴定大肠杆菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测MUG阳性（有荧光）、靛基质阳性（玫瑰红色）,MUG阴性（无荧光）、靛基质阴性（无色）如MUG、I试验为阳性或阴性即可报告结果，如MUG与I试验不一致时，则需分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室273.2MUG试验操作以灭菌吸管取供试品胆盐乳糖增菌培养液、供试品阳性对照培养液、阴性对照培养液各0.2ml，分别加入MUG－蛋白胨培养基（培养基5.7）管，37℃培养4、24h后，将各管置366nm紫外灯下观察有无蓝白色荧光，然后加欧波试液4～5滴于上述MUG管内，观察液面颜色2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室283.2.1MUG法不必分离单个菌落除大肠埃希菌外，尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株；以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌，其MUG为阳性在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠，可排除革兰阳性菌的干扰志贺菌、沙门菌在胆盐乳糖培养基中较难生长，即使有生长，本法能检出。并且既然药品中不得检出大肠杆菌，更不允许检2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室293.2.2配制MUG培养基时，务必校正pH值，灭菌后pH不得过7.4，否则pH值偏高，MUG分解，本身则显荧光分装MUG培养基的试管应挑选，试管、蛋白胨不得显荧光2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室303.2.3供试品培养液接种于MUG培养基中的培养时间，一般在4h、24h观察是否产生荧光，如荧光很微弱，不能准确判断时，可延长培养至48h再观察结果由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同，对底物和底物的浓度反应的差异；培养基中选择因子的影响；培养温度；pH的改变；大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等，对结果的判断亦有影响2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室313.2.4取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外灯下观察，阳性对照管应有较强蓝白色荧光，阴性对照管无荧光。供试品MUG管是否有荧光，应仔细观察比较，或将各管调换位置（阴性管居中），适当倾斜试管。如阳性对照管荧光强烈，影响供试品管与阴性对照管的观察时，亦可移去阳性对照管2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室323.3MUG与靛基质试验结果判定如MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时，将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动，以接种环沾取1～2环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上，培养18～24h，观察EMB或麦康凯琼脂平板有无可疑大肠杆菌菌落生长。当阳性对照的平板呈典型菌落生长时，供试品分离平板无菌落生长，或有菌落但不同于下表所列特征，可判为供试品1g或1ml未检出大肠杆菌2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室33大肠杆菌在不同培养基上菌落形态特征当阳性菌对照平板未生长或生长菌落经检查不是大肠杆菌，应研究原因，重新试验或重新制备供试液，以消除供试品抑菌成分的影响。有疑似菌落生长者，挑取可疑菌落做革兰染色、镜检、IMViC培养基菌落形态典型菌落呈紫黑色，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，有金属光泽。非典型菌落呈浅紫色、粉红色，或菌落中心紫色或无明显暗色中心，无金属光泽。麦康凯琼脂典型菌落呈鲜桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润。非典型菌落呈微红色，或菌落中心呈红色。2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室34大肠埃希菌在EMB、MAC上的特征2005年4月16日星期六中国药品生物制品鉴定所抗生素室353.4疑似菌落的挑选如生长菌落与上表所列特征相符或疑似者，以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心，沾取培养物，应挑选2～