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第六章酶工程制药第一节概述酶的特性酶是生物催化剂，大多数酶的本质是蛋白质，有些酶是核酸。酶作为生物催化剂，除具有一般催化剂的特性：加快反应速度、降低反应活化能、不改变反应平衡点、反应前后无数量和性质变化等外，还具有独自的特点：催化效率高、专一性强、反应条件温和、催化活性易受调节和控制。酶由国际酶学委员会分为六大类：氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂合酶类、异构酶类、合成酶类。一、酶工程简介酶工程（enzymeengineering）是酶学和工程学相互渗透、发展而形成的一门新的技术科学。从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化功能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。20世纪20年代初出现，当时主要是自然酶制剂在工业上的大规模应用，1953年提出固定化酶技术，1969年利用该技术成功拆分了混旋氨基酸。1971年第一届国际酶工程会议提出的酶工程主要内容是：酶的生产、分离、纯化、固定化、固定化的反应器、酶与固定化酶的应用。酶工程的优点是工艺简单、效率高、生产成本低、环境污染小、产品收率高、纯度好、还可制造出化学方法无法生产的产品。现代酶工程的研究内容：1、酶的分离、提纯、大批量生产及新酶和酶的应用开发；2、酶和细胞的固定化及酶反应器的研究；3、酶生产中基因工程技术的应用及遗传修饰酶（突变酶）的研究；4、酶的分子改造与化学修饰、以及酶的结构与功能之间关系的研究；5、有机相中酶反应的研究；6、酶的抑制剂、开发及其应用研究；7、抗体酶、核酸酶的研究；8、模拟酶、合成酶、酶分子的人工设计、合成的研究。二、酶的来源普遍存在于生物体中，可直接从生物体中分离。化学合成方法目前还不成熟。早期是以动植物为原料进行提取，由于动植物生长周期长、来源有限、受地理、气候和季节等因素的影响，不适于大规模生产。利用微生物来生产酶制品是一个更好的选择，优点是：1、微生物种类繁多，动植物体内的酶在微生物中几乎都可以找到；2、繁殖快、生产周期短、培养简便、并可以通过控制培养条件来提高产量；3、微生物具有较强的适应性，通过各种遗传变异手段能培育出新的高产菌株。三、酶的生产菌1、对菌种的要求①繁殖快，产酶量高，酶的性能符合使用要求，最好是胞外酶；②不是致病菌、在系统发育上与病源体无关，不产生毒素；③稳定，不易变异退化，不易感染噬菌体；④能利用廉价原料，发酵周期短，易于培养。2、生产菌来源从菌种保藏机构和有关研究部门获得，从自然界中分离筛选。土壤、深海、温泉、火山、森林都是菌种采集地，筛选包括菌样采集、菌种分离、初筛、纯化、复筛、生产性能鉴定。生产菌的改良，基因突变、基因转移、基因克隆。3、常用产酶微生物1.大肠杆菌：一般属于胞内酶，需要经过细胞破碎才能得到。谷氨酸脱羧酶，用于测定谷氨酸含量或γ-氨基丁酸；天冬氨酸酶，催化延胡索酸加氨生成L-天冬氨酸；苄青霉素酰化酶，生成新的半合成青霉素或头孢霉素；β-半乳糖苷酶，用于分解乳糖。2.枯草杆菌：α-淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。3.青霉菌：产黄青霉用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶；橘青霉用于生产脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶。4.黑曲霉：有胞外酶和胞内酶，糖化酶、α-淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纤维素酶。5.米曲霉：糖化酶和蛋白酶，在传统的酒曲和酱油曲中得到广泛应用。6.木霉：纤维素酶，含有较强的17α-羟化酶，常用于甾体转化。7.根霉：糖化酶、α-淀粉酶、转化酶、酸性蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶，含有较强的11α-羟化酶，常用于甾体转化。8.链霉菌：葡萄糖异构酶、青霉素酰化酶、纤维素酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶，含有丰富的11α-羟化酶，可用于甾体转化。9.啤酒酵母：酿造啤酒、酒精、饮料酒和面包制造。可生产转化酶、丙酮酸脱羧酶等的生产。10.植物细胞：大蒜-超氧化物歧化酶、木瓜-木瓜蛋白酶、菠萝-菠萝蛋白酶。※提高药用酶产量的措施1、添加诱导物对于诱导酶的发酵生产，在发酵培养基中添加适当的诱导物，可使产酶量显著提高。乳糖诱导β-半乳糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶。诱导物可分为三种：酶的作用底物、酶的反应产物、酶的底物类似物。2、控制阻遏物浓度有些酶的合成受到阻遏物的阻遏作用，应设法解除阻遏作用来提高酶的产量。3、添加表面活性剂可分为离子型和非离子型，离子型对细胞有毒害作用，只能使用非离子型，可聚集在细胞膜上，增加细胞通透性，有利于酶的分泌，可增加酶的产量。4、添加刺激剂在植物细胞培养生产次级代谢产物的过程中，添加某些刺激剂可显著提高次级代谢的物的产量。真菌的细胞壁碎片或其有效成分、微生物胞外酶以及一些小分子物质。5、添加产酶促进剂植酸钙镁可使霉菌蛋白酶和橘青霉磷酸二酯酶的产量提高1-20倍。四、酶在医药领域的应用1、在疾病诊断方面的应用酶学诊断：由于酶催化的高效性和特异性，具有可靠、简便又快捷的特点。包括两个方面：一是根据体内原有酶活力的变化来诊断某些疾病，如利用谷丙转氨酶活力升高来诊断肝炎；二是用酶测定体液中某些物质的量诊断疾病，如利用葡萄糖氧化酶测定血糖含量，诊断糖尿病等。2、在疾病治疗方面的应用由于酶具有专一性和高效率的特点，具有种类多、用量少和纯度高等特点。主要医药用酶：①蛋白酶；②溶菌酶；③超氧化物歧化酶；④L-天冬酰胺酶；⑤尿激酶；⑥其他相关酶制剂等1、蛋白酶临床上使用最早、用途最广的药用酶之一。消化剂，用于治疗消化不良和食欲不振，使用时常常与淀粉酶、脂肪酶等一起制成复合酶制剂，以增加疗效，片剂，可口服。消炎剂，对各种炎症有很好的疗效，它能分解一些蛋白质和多肽，使炎症部位的坏死组织溶解，增加组织的通透性，抑制浮肿，促进病灶附近组织积液的排出并抑制肉芽的形成，可口服、外敷和肌肉注射。蛋白酶经组织注射可治疗高血压，由于蛋白酶催化运动迟缓素原及胰血管舒张素原的部分肽段水解生成运动迟缓素和胰血管舒张素，从而使血压下降。2、α-淀粉酶消化药。3、脂肪酶消化剂。假单胞菌脂肪酶能分解血液中的低密度脂蛋白和乳糜微粒，可用于预防和治疗高血脂病。4、右旋糖苷酶水解右旋糖苷生产小分子产物，对龋齿有显著的预防作用，可加到牙膏和嗽口水中。5、溶菌酶抗菌、消炎、镇痛作用，作用于细胞壁，使其受到破坏，而使病原菌、腐败性细菌等溶解死亡。6、超氧化物歧化酶抗氧化、抗辐射、抗衰老、保护机体的DNA、蛋白质和细胞膜免受超氧负离子的破坏。对红斑狼疮、皮肤炎、结肠炎、白内障、风湿性关节炎、氧中毒等疾病有显著疗效对辐射有防护作用。7、乳糖酶治疗乳糖缺乏症，有些人或婴儿肠道中缺乏乳糖酶，饮用含有乳糖的牛奶等食品时，由于不能分解乳糖，在肠道中，乳糖会因为细菌分解而产生有机酸，刺激肠道引起呕吐。8、链激酶可催化纤维蛋白酶原，激活成纤维蛋白酶，将纤维蛋白水解，使血栓溶解。9、尿激酶溶解血栓。3、在药物生产方面的应用酶在药物制造方面的应用是利用酶的催化将前体物质转变为药物。主要应用有：利用青霉素酰化酶制造半合成青霉素和头孢霉素、利用β-酷氨酸酶制造多巴、利用核苷磷酸化酶生产阿糖腺苷、利用蛋白酶和羧肽酶将猪胰岛素转化为人胰岛素等。4、在分析检测方面的应用用酶进行物质分析检测的方法统称为酶法检测或酶法分析。酶法检测可以分为单酶反应、多酶偶联反应和酶标免疫反应等三类。————————第二节酶和细胞的固定化使用均相酶的缺点：只能使用一次，成本高，产品分离困难；酶溶液很不稳定，容易变性和失活。固定化酶的优点：性能稳定；可反复使用，降低了成本，易与产品分离，简化下游操作。一、固定化酶的制备1、定义指限制或固定于特定空间位置的酶。也就是指经物理化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。固定化所用的酶，可以是分离提纯后的酶，也可以是结合成菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。2、特点：既有生物催化剂的功能，又具有固相催化剂的特性。优点：（1）可以多次使用，而且在多数情况下，酶的稳定性提高；（2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化，产品质量高；（3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续化和自动控制；（4）酶的利用效率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量减少；（5）比水溶性酶更适合于多酶反应。缺点：（1）固定化时，酶活力有损失；（2）增加了生产的成本，工厂初始投资大；（3）只能和于可溶性底物，而且较适于小分子底物，对大分子底物不适宜；（4）胞内酶必须经过酶的分离纯化过程；（5）与完整菌体相比不适宜用于多酶反应，特别是需要辅助因子的反应。3、酶的固定化方法与制备技术应根据酶的应用目的和特性，来选择其固定化方法。载体结合法：物理吸附法、离子结合法、共价结合法；交联法：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法及载体交联法；包埋法：网格型、微囊型选择性热变性（专用于细胞固定化）固定化所用的载体以及固定化的技术见课本。1.载体结合法：将酶结合到不溶性载体上的一种固定化方法①物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上。优：操作简单，固定化过程与纯化过程同时实验，载体可再生；缺：最适吸附酶量无规律可循，酶易于脱落，导致活力下降并污染产物。②离子结合法：酶通过离子键结合于有离子交换基的水不溶性载体上。优：操作简单，处理条件温和，酶活回收率高；缺：载体与酶的结合力比较弱。③共价结合法：酶以共价键结合于载体上，也就是使酶分子上非活性部位功能团与载体表面活泼基团之间发生化学反应而形成共价键。优：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落；缺：反应条件苛刻，操作复杂，酶的损失大，起始投资大。2.交联法：用双功能或多功能试剂使酶与酶或微生物的细胞与细胞之间交联。最常用的交联剂是戊二醛。①交联酶法：用多功能试剂使酶分子内或分子间彼此连接成网络结构。②酶—辅助蛋白交联法：在酶溶液中加入辅助蛋白的交联过程。③吸附交联法：吸附与交联相结合，兼有两者双重优点。④载体交联法：同一多功能试剂分子的一些化学基团与载体偶联而另一些化学基团与酶分子偶联的方法。交联法的反应条件比较激烈，酶活回收率一般较低，所得到的固定化颗粒小、结构性能差，酶活性低，常与吸附法或包埋法联合使用。3.包埋法：可分为网格型和微囊型两种。①网络型：将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格中。②微囊型：将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。优：制备条件温和，很少改变酶的高级结构，酶活回收率较高，可应用于很多酶和细胞、细胞器；但是在发生化学聚合反应时包埋酶容易失活，必须合理设计反应条件。缺：只适合作用于小分子底物和产物的酶，而且扩散阻力会导至酶的动力学行为发生改变而降低其活力。近年来正研究一种利用脂质体的包埋方法，由表面活性剂和卵磷脂等形成液膜包埋酶。其特征是底物或产物的膜透性只依赖于对膜成分的溶解度。二、固定化细胞的制备1、定义将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞，它与固定化酶一起被称为固定化生物催化剂。2、特点因定化细胞具有：细胞特性、生物催化功能、固相催化剂特点。优点：无需进行酶的分离纯化；细胞保持酶的原始状态，固定化工程中酶的回收率高；固定化酶比细胞内酶稳定性高；细胞内酶的辅因子可自动再生；细胞本身含多酶体系，可催化一系列反应；抗污染能力强。局限性：利用的仅是胞内酶，而细胞内多种酶的存在会形成不需要的副产物；细胞膜、细胞壁和载体都存在着扩散限制作用；载体形成的孔隙大小影响高分子底物的通透性。3、固定化细胞制备技术细胞的固定化技术是酶的固定化技术的延伸，其制备和应用方法也基本相同，但细胞的固定化要求底物和产物容易透过细胞膜，细胞内不存在分解系统及其他副反应，或有相应的消除副反应的措施。固定化细胞制备方法有载体结合法、包埋法、交联法及无载体法等。三、固定化方法与载体的选择依据1.固定化方法的选择酶与细胞的固定化无特定的规律可循，要根据具体况和试验摸索出具体可行的方法。主要考虑的因素：（1）固定化酶应用的安全性（2）固定化酶在操作中的稳定性（3）固定化的成本2.载体的选择四、固