第21章：免疫学检测及相关实验技术

免疫学检测及相关实验技术第21章免疫学检测是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验手段及分子生物学技术在免疫学研究中的应用。免疫学技术的应用极为广泛,疾病的诊断、疗效评价及理论研究等。第一节免疫学检测原理细胞水平检测分子水平检测基因水平检测一、免疫细胞的检测对机体参与免疫应答的细胞进行分离、纯化、鉴定、计数及功能测定。(一)免疫细胞分离与纯化(1)抗凝静脉血(2)加等量NS(4)密度梯度离心血浆分离液RBCPBMCPMN(3)混匀后，缓慢加于分离液上利用表面标志分离淋巴细胞亚群流式细胞术（FlowCytometry,FCM)FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞的表面标志（抗原或受体）进行快速、精确的分析和自动检测，并将不同类型的细胞分选收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，为当代生命科学研究领域中广泛使用的一项新技术。流式细胞仪工作原理FACS细胞分选FACS技术分析用抗IgM单抗分离B细胞克隆RemovalofTcellsfrommarrowgraftMagnetMagneticantibodies(二)免疫细胞功能测定1.T细胞功能测定(1)细胞增殖(转化)试验：可分为非特异性丝裂原和特异性抗原两类。*丝裂原主要有PHA、ConA和PWM；*抗原刺激物有破伤风类毒素、PPD和白色念珠菌等；*同种MHC及抗CD3单抗等*肿瘤细胞-自体淋巴细胞混合培养淋巴细胞转化试验（形态学示意图）原理：人T细胞表面有PHA或ConA受体，T细胞在体外受PHA或ConA的刺激后能转化为体积较大、代谢旺盛、且能进行分裂的淋巴细胞，以此测定T细胞的功能。PHA刺激48~72小时培养液3H-TdRPHA淋巴细胞全血分层液离心过滤测量放射性淋巴细胞增殖试验（3H-TdR掺入法）示意图靶细胞51Cr洗涤去除游离的51Cr效应细胞测量上清液中释放的51Cr混合培养4-6小时⑵细胞毒试验（51Cr释放法）(3)T细胞功能的体内检测法*移植物抗宿主反应(GVHR)*迟发型超敏反应(DTH)2.B细胞功能测定(1)B细胞增殖(转化)试验(2)溶血空斑形成试验(3)反向溶血空斑试验(4)酶联免疫斑点法(ELISPOT):一种可检测抗体分泌细胞，又可测定抗体分泌量的体外实验方法。溶血空斑实验ELISPOT实验①稳定、特异，且抗原用量少②可同时检测不同抗原诱导的抗体分泌，并可定量检测③可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞3.NK细胞活性测定(1)形态学检查法(2)放射性核素释放法：用放射性核素(51Cr、125I－UdR)标记靶细胞(3)酶释放法：测定靶细胞膜受损后从胞浆内释放至介质中的乳酸脱氢酶(LDH)活性(4)化学发光法(5)流式细胞术4．吞噬细胞功能测定(1)中性粒细胞趋化功能测定滤膜渗透法(Boyden小室法)(2)中性粒细胞吞噬、杀菌功能测定1)显微镜检法2)NBT试验3)化学发光测定法(3)巨噬细胞吞噬功能测定(4)巨噬细胞细胞毒测定免疫球蛋白的测定补体测定细胞因子及其受体检测黏附分子的检测二、免疫分子的检测细胞因子及其受体的检测生物学测定法免疫学检测法分子生物学测定法细胞因子受体检测的基本技术根据细胞因子对特定的生物学活性,应用相应的指示系统,同时与标准品对比测定,从而得知样品中细胞因子的活性水平,一般以活性单位(U/ml)表示。生物学测定法1、促进细胞增殖和增殖抑制法3H-TdR掺入法、比色法（MTT、WST-1）染色法直接计数法2、细胞毒活性测定法51Cr释放比色法（MTT、WST-1）3、集落形成法4、细胞病变抑制法5、趋化活性测定法免疫学检测的基本原理是将细胞因子作为抗原进行定量检测。如免疫斑点法、ELISA法、RIA法和免疫印迹法等均已用于细胞因子的检测。某些细胞因子含量甚微的样品(如脑脊液)可用免疫聚合酶链反应(immuno-PCR)进行检测。免疫学检测法分子生物学测定法RNA印迹法、核酸酶保护分析、原位杂交、PCR和RealTimePCR等。亦可通过检测细胞内细胞因子的基因组成或mRNA量，推算出细胞因子的合成量。CKR检测的基本技术细胞因子的广泛生物学活性是通过与各自相应的受体结合而发挥的。因此细胞因子受体的检测与细胞因子检测一样，已成为基础理论和临床免疫学研究的一个重要内容。粘附分子的检测某些粘附分子除表达于细胞膜表面外，还以可溶性形式存在于体液中。粘附分子的检测方法目前大多采用免疫学技术检查其在细胞膜上的分布和测定某些样品中的含量。三、免疫相关基因检测*包括各种类型的杂交技术，如转印杂交、斑点杂交、原位杂交等以及PCR技术等。*杂交技术主要工具是核酸探针，它是指一段用放射性核素或其他标记物(生物素、荧光素、地高辛等)标记，并与目的基因互补的DNA片段或单链DNA、RNA。分为cDNA探针、寡核苷酸探针、基因组DNA探针及RNA探针等。㈠细胞因子基因组DNA或mRNA的检测1.Northern杂交分析2.斑点及狭缝印迹杂交:将DNA变性后直接点样于硝酸纤维膜上再进行杂交3.原位杂交法4.PCR扩增产物杂交分析：将细胞因子的mRNA经过逆转录为cDNA，用特异性细胞因子引物进行PCR扩增，通过Southernblot后，再用标记探针检测特异细胞因子DNA的水平。5．Southern印迹杂交㈡BCR及TCR克隆性基因重排分析1．Southern印迹杂交法：仅适用于科研，而不适用于临床诊断。2.PCR扩增技术:免疫印迹法示意图PCR扩增技术:正常多克隆淋巴细胞群DNA的扩增产物含有不同长度的片段，电泳检查呈现弥漫涂片状结构或多条带。而单克隆性基因重排经PCR扩增后，产生明显相同长度的片段，电泳呈现单一紧密折带状结构。•应用PCR扩增技术进行基因诊断具有特异、敏感(1/104~1/105克隆性细胞)、快速(24h可完成)等优点。•用于恶性淋巴瘤和白血病等的临床诊断以及白血病治疗后微小残留病灶的检测。㈢HLA基因分型技术1．序列特异性寡核苷酸探针PCR(PCR-SSOP)或PCR-ASO:应用最多的一种简单、快速而又精确的HLA-Ⅱ类抗原分型方法，能鉴定所有已知序列的HLA-DR、DQ、DP等位基因，精确地分析DNA的多态性。2．限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术：此项技术特别适用于个别标本和小样本的检测。3．单链构象多态性PCR(PCR-SSCP)：藉此可鉴别编码HLA-Ⅱ类抗原基因的多态性。应用PCR-SSCP可以直接比较供、受体之间HLA-Ⅱ类基因是否完全一致，且可精确到12个碱基之差，具有相对简捷而精确的特点。在异基因骨髓移植的配型中已初步应用于临床。4．序列特异性引物PCR技术(PCR-SSP)：该法操作简单、快速、实验结果容易判断，杂合子也很易检出。不足之处在于，为检出所有的等位基因必须用多个引物进行扩增。5．指纹图谱(PCR-fingerprinting)技术：进行HLA-基因分型鉴定时，将供、受体的DNA扩增产物混合，电泳后得出一指纹图，再与二者各自的PCR指纹图谱进行比较，从中选择出指纹图一致的供、受体进行移植。*PCR指纹图谱在选择非亲缘关系的供、受体进行骨髓和器官移植配型时，可以节省大量时间。6.SNP(单个核苷酸多态性)分析四、免疫标记技术免疫荧光技术放射免疫分析法酶免疫技术发光免疫测定Ag*AbAg标记抗原特异性抗体待测抗原(Ag*-Ab)+(Ag-Ab)抗原抗体复合物分离Ag*-Ab和游离Ag*从标准曲线上读知含量测定Ag*-Ab和/或游离Ag*放射性放射免疫测定法(RIA)示意图形态学方法普通光学显微镜检测法荧光显微镜检测法材料：①石蜡切片;②冰冻切片;③细胞学涂方法:电镜观察凋亡小体生化学方法免疫学方法末端标记法细胞凋亡的检测形态学方法：①PI染液：碘化丙啶(propidiumiodide,PI)；核红色②DAPI染液；核蓝白色③AO染液：核黄绿色*凋亡细胞呈现核浓缩,染色加深,凋亡小体。凋亡的形态学检测U937Cell（DAP1染色）大鼠结肠组织（AZON染色）荧光显微镜观察细胞凋亡生化学方法电泳法DNALadder电泳图谱原位末端转移酶标记技术(TdT或TUNEL)凋亡细胞由于内源性核酸内切酶的激活,核DNA被切割成许多双链DNA片段以及高分子量DNA单链断裂点(缺口),暴露出大量3‘羟基末端,如用(TdT)将标记的-dUTP进行缺口末端标记,则可原位特异地显示出凋亡细胞。(一)荧光标记法(二)酶标记法检测原理及方案U937细胞（荧光素染色）教学要求1、掌握三个水平的免疫学检测技术2、了解免疫细胞的检测3、了解免疫分子的检测4、了解免疫相关基因的检测5、了解免疫标记技术