ELISA的基本原理1

ELISA(enzymelinkedimmunosorbentassay)重庆市疾病预防控制中心彭靖尧背景―免疫标记技术免疫标记技术原理：利用抗原抗体反应的原理，于抗原或抗体上加载各种标志物，抗原抗体反应中加入标志物示踪，利用标志物的可测量性来达到快速、敏感地检测各种体内微量生物活性物质。特点：特异性、专一性、高效性。发展1941年Coons建立荧光抗体技术1959年Yalow和Berson创建放射免疫分析1971年Engvall和Perlaman以及Weeman和Schuur用酶代替放射性核素制备了酶标记物，创立了酶免疫分析技术酶免疫技术的要点固相载体酶和底物试剂工作条件的选择固相载体与抗原抗体易于结合，结合稳定不易脱落能结合抗原抗体免疫反应复合物固相化后保持活性（活性基团朝向反应液）固相化方法简便易行酶和底物酶催化活性高、低浓度—高效率能与抗原（体）共价交联，稳定且不影响免疫反应活性催化底物产生有色信号易于测量、重复性好酶活性不易受影响、稳定（可较长时间保存）、对人体无害常用有HRP和AP试剂条件的选择主要是最佳工作浓度的选择防止本底高、灵敏度低常用棋盘法酶联免疫吸附测定——ELISA是在酶免疫技术上发展起来的固相酶免疫测定抗原（抗体）结合到固相载体表面标本和酶标抗体（抗原）与固相上抗原（抗体）反应洗涤、加酶反应底物，通过被酶催化产生的颜色及吸光度值定性、定量ELISA（Enzyme-linkedimmunosorbentassay——酶联免疫吸附实验）是20世纪60年代发展起来的免疫学检测技术，也是目前应用最广泛的传染病检测方法。ELISA的特点：敏感度和特异度较高，重复性好。试剂比较稳定，易于保存。操作简单，价格便宜，易于在基层大规模使用。易于标准化和对检测对象进行定量。可以自动化。ELISA的基本原理抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性而能相互特异性结合。将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感性。抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定量分析。ELISA的种类测抗原：竞争法、双抗体夹心法。测抗体：间接法、捕获法、双抗原夹心法ELISA的种类检测抗原：竞争法ELISA——标本中的抗原和一定量的酶标抗原竞争与固相抗体结合，标本中的抗原含量越多，结合在固相上的酶标抗原越少，显色越浅。将特异性抗体包被于固相载体表面，洗涤后分为两组，一组加入酶标抗原和被测抗原的混合液，另一组只加入酶标抗原，经孵育洗涤后加底物显色，两组吸光度之差就是所测定未知抗原的量。包被特异性抗体酶标抗原检测抗原孵育洗涤后显色加样AB竞争法ELISA3.显色3.孵育1.加样特点酶标抗原（抗体）与样本中的非标记抗原（抗体）具有相同的与固相抗体（抗原）结合的能力固相抗体（抗原）和酶标抗原（抗体）固定限量，且前者集结合位点少于酶标和非标的分子数量和反应好后，固相上结合的酶标抗原（抗体）量与样品中的非标记的抗原（抗体）浓度成反比主要用于小分子抗原或半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。检测抗原：双抗体夹心法ELISA——将特异性抗体包被于固相载体表面，与标本中相应抗原相结合，洗涤后再加入酶标的第二特异性抗体与抗原结合，加入底物后显色。包被特异性抗体双抗体夹心法ELISA检测抗原1.加样2.孵育3.洗涤4.加入二抗5.孵育6.显色酶标特异性抗体特点检测抗原要有至少具有2个抗原决定簇不能用于药物、激素中小分子半抗原检测类风湿因子（RF）的干扰、现采用F(ab’)或者Fab片段作酶结合物的试剂检测抗体：间接法ELISA（IndirectELISA）——将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗人IgG或IgM抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。1.加样2.孵育3.洗涤4.加入二抗5.孵育6.显色间接法ELISA特点酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子只需要变换包被抗原，就可用一种酶标二抗检测各种与抗原结合的抗体检测抗体：捕获法ELISA（CaptureELISA）——专门用来检测IgM型抗体的方法。将抗人IgM抗体包被于固相载体表面，与标本中所有人IgM抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相应的特异性IgM抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。1.加样2.孵育3.洗涤4.加入抗原孵育5.加入二抗孵育6.显色捕获法ELISA特点多用于测IgM,感染早期诊断包被抗抗体，非特异性结合（捕获）检测抗体：双抗原夹心法ELISA——检测标本中的总抗体（包括IgM和IgG型抗体）。将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中特异性IgM和IgG型抗体结合，洗涤后加入酶标的特异性抗原与相应的抗体结合，洗涤后加入底物显色。3.洗涤1.加样2.孵育6.显色5.孵育4.加入酶标抗原双抗原夹心法ELISAELISA试剂的组成固相载体：许多物质可以作为固相载体，如纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙稀和聚苯乙烯等等。目前最为常用的是聚苯乙烯材质的微孔板，多为8×12道96孔板条。吸附能力通透性均一性酶标记物：酶与抗体的共价结合首先不影响酶及抗体的活性、不产生干扰物质、不产生非特异反应。辣根过氧化物酶（HorseRadishPeroxidase，简称HRP）是目前应用最为广泛的酶，是从辣根菜的根中提取。碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase，简称AP）是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提取工艺复杂，价格比较昂贵。底物：不同种类的酶要求使用不同的底物。HRP——邻苯二胺（Orthopenylenediamine，OPD）、四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS『2,2‘-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)』，OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便，作用后变橙红色，其缺点是配成应用液后稳定性差。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，加酸停止酶反应后变黄色。AP——对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA在洗涤时应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，应严格按要求洗涤。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，一般是吐温20（聚山梨酯）。洗板时注意不同试剂盒的洗液不要混用。标本稀释液：用来稀释血清标本，有时也稀释酶结合物。RF吸附剂：在进行IgM抗体检测时，间接ELISA方法需要使用RF吸附剂去除类风湿因子的干扰作用。结果判断S/CO：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，表示的是标本测定的吸光度值，CO为Cut-off值的简写。除竞争抑制法外，其它ELISA定性测定模式中，当S/CO值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性。S/N或P/N：其中S为Sample(样本)或Specimen(标本)的简写，N为Negative(阴性对照)的简写，P为Patient（患者）的简写。较早的试剂盒很多都使用S/N或P/N≥2.1为阳性判定标准，现仍有一些试剂盒使用这种方式。这种方式与S/CO方式无根本性区别，只不过是前者将阴性对照（N）的2.1倍视为Cut-off值而已。注意事项临床标本的收集和保存ELISA测定中试剂准备加血清样本反应试剂温育的时间与温度ELISA测定的洗版显色比色结果的判定ELISA的操作要点严谨的设计，优质的试剂，正确的操作和良好的仪器是保证ELISA必要条件。严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。检测麻疹/风疹IgM抗体方法介绍间接法血清预处理ELISA间接法使用RF吸附剂类风湿因子（10％）是一种自身抗体，主要有IgM组成，能与抗原抗体复合物的FC段结合，非特异性IgM抗体（风湿因子）的存在将导致IgM检测出现假阳性结果。麻疹IgG麻疹抗原麻疹IgM抗人酶标IgM抗体类风湿因子另外，也存在弱结合的病原体特异性IgM抗体被强结合的IgG抗体取代的可能性。在这种情况下，IgM的检测将得到假阴性的结果。麻疹IgG麻疹抗原麻疹IgM酶标抗人IgM抗体因此，在进行IgM检测前应用类风湿因子吸附剂对血清作预处理;对IgG用A蛋白和抗IgG抗体处理。捕获法抗人IgM抗体非特异性捕获病毒抗原酶标抗体（1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM.（2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。（3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。（4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。（5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。标本的采集、运输和保存RelativelevelsofantibodyIgMsensitivity~70%071421283542-7-14-210246810RashonsetDaysafterrashonsetIgGIgMInfectionvirusexcretion用于IgM抗体检测的血清标本要在初次接触病人时马上采集，以及出疹后28天内采集用于病毒分离的标本,需出疹５天内采集咽拭子或尿液麻疹病毒感染体液免疫过程必要日期:最后接种日期出疹日期出生日期血清分装：必须使用血清保存管储存血清，2ml螺口塑料管(外螺旋、带密封垫圈)，可耐深低温。标本登记:实验室在收到送检标本后，应检查标本并核对申请单，按要求逐项认真进行标本登记，如一周内不进行检测实验，将标本放置在-20℃更低温度保存。血清运输：分离后的血清可在4～8℃的条件下运送和短期保存,可在4℃存放一周，长期保存需置于-20℃或更低温度保存。根据2006年1月11日卫生部制定的（人间传染的病原微生物名录），麻疹、风疹血清标本属于B类包装，按编号UN3373的要求包装和运输。