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许燕晴08411441摘要本文在筛选获得一批酒精发酵力较强的二倍体酿酒酵母菌株的基础上，优化产孢条件，应用筛选获得的高产酒精的单倍体菌株，经杂交育种构建高产酿酒酵母菌株。以二倍体菌株ZJD3一3、ZJD3一4、ZJD3一7、ZJD3一9和ZJD3一11(称为ZJD3系列)及非整倍体菌株c19为实验菌株，经对产孢培养基的优选，确认McClary产孢培养基为适宜的高产孢率培养基。在该培养基上经25℃、7天培养，酿酒酵母的产孢率可达到47%。对ZJD3系列二倍体菌株进行单倍体分离，获得单倍体71株。对筛选所得单倍体菌株，以及实验室原有单倍体菌株c36、c36一8、c36一9进行交配型和发酵性能测定，交配型为a型的单倍体与交配型为α的单倍体数目差异较大。得交配型a的单倍体菌株30株，交配型α的单倍体菌株18株。从中筛选获得发酵性能较强的单倍体菌株4株，其中1株为a型，3株为α型，发酵性能最强的zs-5菌株其同等条件下酒精发酵后的酒度高出二倍体亲株4.5%。以得到的4株强发酵菌株和单倍体菌株c36、c36一8、c36一9以及非整倍体菌株C19为杂交亲株，分别进行群体杂交，发现不同交配型单倍体混合2h后开始出现哑铃型细胞，平板分离培养48h后，经鉴定共获得杂合子124株，经酒精发酵测验，从中筛选获得发酵性能优良的酵母菌株6株。结果表明，95%以上的杂合子酒精发酵性能优于杂交亲株，最优者比杂交单倍体亲株提高17.7%，比原始二倍体菌株高15.5%。经杂交育种与重复酒精发酵测验，最终确认zj一1、zj一2、zj一3、zj一、zj一5、zj一6等6株高产酒精的菌株，为进一步选育构建超级工程菌株奠定了扎实基础。前言酒精生产用酿酒酵母属于子囊菌亚门中的酵母菌科成员，主要以出芽方式进行繁殖，属单细胞真核微生物。利用酿酒酵母发酵糖类生产乙醇的历史非常悠久，目前世界乙醇产量的80%以上是通过酿酒酵母以淀粉质或其他糖质原料发酵生产的.酵母菌在厌氧条件下发酵己糖生成酒精，其生化途径主要由两个阶段组成。第一个阶段为己糖通过糖酵解途径(EMP途径)分解生成丙酮酸。第二个途径丙酮酸由脱羧酶催化形成乙醛和二氧化碳，乙醛进一步被还原生成乙醇。葡萄糖发酵生成乙醇的总反应简式为:C6H206→2C2H50H+2C02+能量就理论而言，酿酒酵母行酒精发酵，每消耗1mol葡萄糖可产生2mol乙醇，即180克葡萄糖产生92克乙醇，理论得率为51.n%。可在生产实际中，远未达到此得率。原因是酵母发酵过程中除主要生成乙醇外，还生成少量的其他副产物，包括甘油、有机酸(乙酸、乳酸、墟拍酸等)、杂醇油(高级醇)、醛类等，大约有4一10%的碳源将被用于形成副物，加之工艺条件与其他环境因素的影响，实际可发酵性糖的利用率更低。我国目前工业规模的酒精生产因不同地区、企业、所用原料与酵母种类、工艺条件等方面的差异，糖醇转化率一般在85一90%之间。自改革开放以来，由于我国经济与社会的持续快速发展，能源需求快速增长与供给能力严重不足的矛盾日益突出，环境空气污染的日益加剧，己经成为制约社会可持续健康发展的瓶颈之一。2000年后，国家开始具体实施发展可再生、替代性、环保型能源战略，先后在我国黑龙江、吉林、河南、安徽四省布局建设以农作物所含有淀粉或糖质原料生产可再生、环保型、替代性能源—---燃料乙醇的定点生产基地，2006年生产规模已达到100余万吨，并以较快速度发展至本五年计划末达到近500万吨/年的生产规模。由于燃料乙醇的大规模生产消耗了数量比较巨大的淀粉与糖质原料，导致相应原料的市场价格较快速上扬，燃料乙醇生产成本不断上升，虽然现燃料乙醇定点生产得到国家一定的财政补贴，但目前原料价格上涨幅度已使燃料乙醇生产企业濒临亏损边缘。因此，构建酒精高产酵母，对于降低燃料乙醇生产成本，确保燃料乙醇生产企业利润，促进其自身稳定发展，顺利实现国家新能源战略目标，保持社会与经济可持续健康发展等均具重要的意义。长期以来，提高酵母酒精发酵的得率不外乎探索新发酵工艺和选育高产酿酒酵母菌株。高产菌株的选育主要是从自然界或已知能产酒精的酵母中分离筛选。从自然界筛选的野生酵母一般很难具有用于发酵工业生产的理想特性，需要进一步的驯化培养和利用育种技术进行改良，使其达到工业大生产的要求。诱变育种是菌种选育的重要方法之一，通过各种物理和化学因子诱变，能够得到性能增强的酵母菌株。随着原生质体融合和基因工程技术的不断成熟，采用原生质体融合和重组DNA技术实现高产酒率酿酒酵母菌株的构建，其研究报道屡见不鲜。通过代谢工程手段阻断酿酒酵母甘油的合成或降低甘油的合成量，以提高乙醇发酵的糖醇转化率，也已有实验室条件下获得成功的报道。可见工业微生物优良菌株的选育从自然选择、驯化育种、诱变育种、杂交育种、代谢调节育种发展到基因工程育种，在减少盲目性、省时、降低工作量、提高选育效率等方面已取得长足的进步。工业微生物遗传育种，选用哪种或先后采用哪几种方法为宜，应根据所用菌株的特性，目的产物生成的代谢途径与调控模式、工业化实际应用时的工艺条件等因事制宜，具体把握。酿酒酵母属真核生物，结构组成与代谢调控体系复杂。酿酒酵母酒精发酵的代谢，属细胞基础代谢范畴，酵母细胞高效率吸收利用可发酵性糖生长代谢生成乙醇的效率受细胞全能性调控网络协调控制，属本源性多基因、多步骤、全局性高度协调的基因表达调控模式。因此，要人为地方向明确地提升其代谢水平，又要使其良好适应环境多变的大规模工业生产条件并收到实效，技术难度极其大。作者所在实验室曾用高温热击、多级诱变为主的技术途径，在技术创新上有所突破，成功选育耐高温、高转化率酒精生产菌株，并在酒精工业上实际应用，取得较显著的经济与社会效益。该技术体系虽目前与今后仍不失为一种行之有效的高产酵母选育方法，但该研究成果的问世几近十年，工耗大、费时多、周期长和效率低。现尚未见通过基因或代谢工程获得工业化高效率酒精生产菌株的报道。这主要是由于基因工程技术在工业微生物育种方面虽已取得不少成果，但目前的技术水平主要适用于新增受外源基因及其调控系统调控的代谢类型，或内源性单基因、寡基因控制的代谢水平的提高。酵母杂交在基础研究与酒精高产酵母选育方面，有关专著与论文中可见报道，它是一种相对传统的微生物育种手段，通过杂交可以把不同菌株的优良经济性状集于重组体中，克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷;通过杂交可以扩大变异范围，改变产品的质量和产量，甚至出现新的品种，实践中已取得不少成果。例如，日本的小田等人用酒精酵母和卡尔斯伯酵母杂交获得的杂交株，其乙醇产量和菌体生长量都比亲本有显著的提高，且发酵麦芽糖的能力比亲株明显增强。但止目前尚未见较为系统地探索研究酒精生产工业菌株的杂交育种规律，成功构建工业化规模应用的高性能酒精酵母菌株的报道。本文试图结合工业化高产酒精酵母构建课题的研究内容，对现有优良的工业化应用的酒精生产菌株的产孢条件、子囊发育、产孢率、交配型分布规律、杂交与及其子代中高产株的分布与产酒优势性状的分离组合规律等进行较为系统地研究，为建立相对高效率的通过杂交选育构件酒精高产酵母菌株的技术体系莫定基础，同时为促进遗传学理论与技术的发展做出新的贡献材料与方法1.菌株酵母二倍体：ZJD3-3ZJD3-4ZJD3-7ZJD3-9ZJD3-11非整倍体：C19单倍体：C36C36-8C36-9Z2-3Hs25Hs27培养基固体斜面完全培养基(YPD）1%酵母提取物2%葡萄糖2%蛋白胨1.5%琼脂pH自然115ºC湿热灭菌30min，用于制备斜面和平板。产孢培养基(McClary)葡萄糖0.1%KCI0.18%NaAC0.82%酵母膏0.25%琼脂2%产孢培养基(SPM)葡萄糖0.1%KCll%KH2P045mmol/L酵母膏0.25%琼脂2%基本培养基葡萄糖2%KH2PO40.1%MgSO4.7H2O0.05%(NH4)2SO40.5%琼脂2%PH6.0酒母培养基玉米面粉糖化缪，加糖化酶过夜(20~24h)后，缪液用两层纱布过滤，取滤过液，加水调整其糖度为14Bx。115ºC湿热灭菌30min。如暂不使用，则置于-20℃冰箱中冷藏，化冻后再灭菌使用。发酵培养基23一26ºBx的玉米面粉糖化缪，不需要糖化过夜与过滤。加压闷煮lh后，直接使用。无需灭菌。甘油保种培养基50%甘油十50%YPD（加琼脂的固体培养基)，分装至甘油管中。115ºC湿热灭菌3Omin，用于保种。试剂斐林试剂甲液:精确称取分析纯硫酸铜(CuSO4·5H2O)69.278克，加水溶解后，稀释定容至1000毫升。乙液:称取酒石酸钾钠(KNaC4H4O64·H2O)346克和氢氧化钠(NaOH)100克，加水溶解后，稀释定容至1000毫升。0.2%标准葡萄糖溶液取分析纯葡萄糖置105一110ºC干燥1.5一2h，冷却后，精确称取2.000克，溶于水后，稀释定容至1000毫升。液化酶20000u/ml，糖化酶100000u/ml，O.1N氢氧化钠称取4克分析纯氢氧化钠(NaOH)，溶于少量已煮沸并冷却的蒸馏水中，弃去下面碳酸钠沉淀物，取上层清液，用上述蒸馏水稀释至1000毫升。1%次甲级蓝溶液称取次甲级蓝1克加水溶解，稀释至100毫升。1%酚酞指示剂称取酚酞1克，溶解于100毫升95%酒精中。0.85%氯化钠溶液(生理盐水)0.8一0.9Kg/cm²压力下高压蒸汽灭菌20minSN浓硫酸量取比重为1.84的分析纯浓硫酸135毫升，缓缓注入已盛有800毫升水的1000毫升容量瓶中，待冷却至常温后，加水稀释至刻度。柠檬酸一磷酸缓冲液(CPB)0.lmol/L柠檬酸0.2mol/LNaHPo4(0.8一0.9Kg/cm²压力下高温蒸汽灭菌)10%蜗牛酶，使用前用高渗CPB缓冲液配置，0.45um滤膜抽虑灭菌10%琉基乙醇主要设备与器材台式离心机，TGL一16C，糖液计，一2~5，0~10，10~20，20~30，酒精计，0~10，10~20，电热恒温水槽，DK-8B，电子天平，MettlerPM460显微镜，XSJ一l血球计数板，XB一K-25,灭菌锅，ZDX一35BI，振荡器，HZ一931IK、Hz一2010K，磁力搅拌器，电热恒温培养箱，DHP一908，冷冻摇床，HZ一93IOK，pH计，烘箱，单倍体的获得诱导孢子形成的方法将酿酒酵母菌株于YPD固体斜面上28℃培养48h活化，活化两次后接入产孢培养基，25℃培养3一7天，在显微镜下观察子囊孢子形成情况，计算一个视野内酵母总数和子囊孢子数，并计算产孢率。产孢率(%)=子囊孢子数量/总细胞数子囊孢子分离和单倍体的获得菌株活化后接入产孢培养基，3天后镜检观察，无菌水(2ml)倾于斜面上，用接种环刮下菌体，收集菌悬液于7ml离心管中，6000rpm离心10min收集菌体。0.85%生理盐水悬浮洗涤1~2次，分别加入0.7mlTris一Hcl(pH8.0，0.01M);200ul10%蜗牛酶(终浓度为0.02):l00ul10%琉基乙醇(终浓度为0.01)，120rpm(缓慢振荡)培养16h破子囊壁，使孢子释放。利用孢子比营养细胞耐热特性，采用58℃高温致死处理营养细胞，离心收集孢子，并用Tris一HCI(pH8.0，0.01M)洗涤两次。取适当稀释倍数，涂布于YPD平板上，28℃培养2一3d。单倍体的鉴定培养后挑取小菌落，镜检观察是否为单倍体。将获得的疑是单倍体再接入产孢培养基，培养7天左右观察子囊形成，以确定是否为真正的单倍体。有子囊形成者基本确认为二倍体，不形成子囊者基本确认为单倍体。把确定为单倍体的菌株分别保种(YPD斜面、甘油管)。单倍体交配型的确定单倍体菌株与标准菌株在YPD斜面活化后，分别接种到装有10mlYPD液体培养基的250ml三角瓶中培养，30°C，200rpm/min，24h。取lml待测的单倍体菌株菌液和lml标准菌株菌液接种到新鲜的10mlYPD液体培养基中，30℃，200rpm/min镜检观察哑铃形细胞产生，混合菌液培养过夜后离心(300rpm/min，5min)，菌体沉淀后接种到产孢培养基中培养3