培训讲座――分子标记

分子标记简介王深浩中国农业科学院研究生院主要内容分子标记及其相关概念分子标记的类型与发展几种分子标记介绍1.广义的分子标记(molecularmarker)是指可遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。蛋白质标记如种子贮藏蛋白同工酶（指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子形式）一.分子标记相关概念2.狭义的分子标记概念只是指DNA标记能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。分子标记来源于DNA水平的突变突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异，不管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改变。突变产生的变异是自然选择的基础。可遗传的突变在群体中扩散从而产生多态性。多态性(Polymorphism)－群体内同一DNA序列的两种或多种变异形式，统计表明：群体内任何两个生物个体平均每1000～10000个碱基对有一对有差别，这种差别就是多态性。3.分子标记的特点(相对形态，细胞，生化标记具有的优点)：（1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题；（2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限；（3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造；（4）表现为中性，不影响目标性状的表达；（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体。二.分子标记的类型与发展1.分子标记的类型①基于杂交的分子标记，如RFLP（Restrictionfragmentlengthpolymorphism,即限制性长度片段多态性）。②基于PCR的分子标记，它又分为两类：RAPD（RandomamplifiedpolymorphicDNA）DAF（DNAamplificationfingerprinting）SSCP（Singlestrandconfirmationalpolymorphism）小卫星DNA（MinisatelliteDNA）微卫星DNA（MicrosatelliteDNA）,又称SSR（Simplesequencerepeat）ISSR（Intersimplesequencerepeat）AP-PCR（ArbitraryprimerPCR）它主要有SCAR（Sequencecharacterizedamplifiedregion）STS(Sequencetaggedsite)基于PCR技术的DNA扩增方法AFLP（Amplifiedfragmentlengthpolymorphism）AFLP是先酶切，再用特殊设计的引物进行扩增CAPS（Cleavedamplifiedpolymorphicsequence）CAPS是先扩增，再酶切扩增片段PCR与酶切相结合的方法③基于DNA序列和芯片的分子标记，如SNP（Singlenucleotidepolymorphism）。分子标记的发展...CAPACITY1985199019952000Multi-SSRsAFLPsSSRsRAPDsRFLPsDArTSNPsHiSpeedsequSRAP,TRAP三.几种分子标记介绍1.限制性片段长度多态性标记RestrictionFragmentLengthPolymorphismRFLP：限制性片段长度多态性，为第一代多态性记。原理：RFLP是由于染色体上单核甘酸突变或插入及缺失突变导致限制性酶切位点的增加或减少，从而导致DNA酶切片段长度的变化，这种变化的检测通常是应用同位素或酶联免疫标记探针进行检测。RFLP原理示意图GTAGTCGATTGTCGAGAATTCGTCGGTGGTAAGCATCAGCTAACAGCTCTTAAGCAGCCACCATTCEcoRIEcoRI酶切位点单碱基突变导致RFLP多态性RFLP是由DNA一级水平的变异造成的。然而，如果DNA变异的位点不在内切酶位点，变异则很难被检测到，这个缺陷可以用增加内切酶的种类来弥补。这在实际工作中，单一酶切产生的多态性极其有限，主要取决于亲本材料的来源。正常情况下用到6到8种酶来筛选多态性。不同的酶产生的多态性大不相同。技术路线：不同个体DNA的提取酶切凝胶电泳分开DNA片段转膜Southern杂交数据分析RFLP的特点A不受环境条件和发育阶段的影响B是共显性的C需要对探针进行标记，还要Southern杂交，耗时费力DDNA需要量大，难以用于大规模的育种2.随意扩增多态性DNA标记—RAPDRandomAmplifiedPolymorphismicDNA由单个短的随机序列引物对基因组进行PCR扩增，当两个反向互补引物结合位点间距离满足PCR扩增条件，就可以产生扩增片段。􀀹RAPD扩增产物的多态性是由于引物结合位点或结合位点间发生了重排、缺失或突变导致扩增产物的缺失。原理基因组中存在或长或短的被间隔开的颠倒重复序列WMWMRAPD原理示意图电泳图3、简单重复序列标记—SSR（simplesequenceRepeats）或者称为微卫星DNA（microsatelliteDNA）原理：微卫星DNA是一种广泛分布于真核生物基因组中的串状简单重复序列，每个重复单元的长度在1—5bp之间，常见的微卫星如(TG)n、(GA)n、(AAT)n或(GACA)n等，不同数目的核心序列呈串联重复排列，而呈现出长度多态性。SSR座位两侧一般是相对保守的单拷贝序列，据此可设计引物，其关键是首先要了解SSR座位的侧翼序列(FlankingRegion)，寻找其中的特异保守区。GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAABCABCSSR原理示意图技术路线：建立DNA文库筛选鉴定微卫星DNA克隆测定这些克隆的侧翼序列设计特异性引物来扩增SSR序列经聚丙烯酰胺凝胶电泳、染色比较谱带的相对迁移距离，便可知不同个体在某个SSR座位上的多态性。SSR电泳图微卫星标记的优缺点：（1）微卫星DNA数量多且均匀分布在基因组中。（2）微卫星DNA具有丰富的多态性，并且微卫星位点检测可以显示纯合子和杂合子。（3）微卫星检测容易、重复性较好、省时，适合于进行自动化分析。优点缺点：SSR标记的建立首先要对为微卫星侧翼序列进行克隆、测序、人工合成设计引物以及标记的定位、作图等基础性究，因而其开发有一定的困难，费用也很高。SSR标记技术的应用构建连锁遗传图谱遗传多样性的研究种质资源鉴定分子标记辅助育种4.扩增片段长度多态性标记—AFLPAmplifiedFragmentLengthPolymorphism1992年由荷兰科学家Zabeau和Vos发展起来的一种检测DNA多态性的新方法。定义由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测。AFLP是在RFLP的基础上发展起来的，差别在于检测手段。􀂇AFLP的关键是设计选择性扩增引物以及不同引物组合。原理：AFLP是建立在基因组限制性片段基础上的PCR扩增。由于单核甘酸突变或插入及缺失突变导致增加或减少限制性酶切位点，这种差异可通过选择性的PCR扩增而检测使用特定的双链接头与酶切DNA片段连接作为扩增反应的模板,用含有选择性碱基的引物对摸板DNA进行扩增,选择性碱基的种类、数目和顺序决定了扩增片段的特殊性,只有那些限制性位点侧翼的核苷酸与引物的选择性碱基相匹配的限制性片段才可被扩增。扩增产物经放射性同位素标记、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,然后根据凝胶上DNA指纹的有无来检出多态性.原理示意图AFLP技术路线1.基因组DNA被酶切成小片段：通常用一个四个碱基识别位点的限制性内切酶如MseI和一个六个碱基识别位点的酶如EcoRI，其中MseI确保产生合适大小的DNA片段，这些片段能在序列胶上进行有效的分离；而六碱基识别位点酶EcoRI能够限制扩增片段数目，确保DNA多态性的正常检测；2.接头与酶切片段的连接：接头序列包括：一个核心序列和酶切位点特异序列，MSE接头和ECORI接头，核心序列是一段已知的20核甘酸的DNA序列；3.预扩增：应用一对引物对酶切片段进行第一轮扩增，目的是富聚目标片段，减少本底，扩增引物序列为接头序列加一个选择核甘酸。只有一端为EcoRI切点，一端为MseI切点的DNA酶切片段，同时也与选择核甘酸配对的DNA序列才能被扩增。1～3步的产物可以通过Agarose胶检测。4.选择扩增：应用含有接头序列和三个选择核甘酸序列的引物进行选择扩增。通过这一轮扩增，进一步降低扩增片段数量，同时一个引物被同位素或荧光染料标记（也可用银染），电泳后压片检测。AFLP电泳图select20polymorphismmarkersfrom256primers123123123123优点1）非常高的基因型分析效率；􀂇2）不需要标记开发成本，但是需要优化特异引物及引物组合；􀂇3）不需要基因组DNA序列信息；􀂇􀂇4）AFLP分析只需要很少量的DNA；(typically0.2to2.5μgperindividual).􀂇5）AFLP可应用于任何生物。缺点1）需要高质量的DNA，以确保酶切完全；2）从单个多态性DNA片段开发位点特异性标记相当困难；3）多数情况下采用的是同位素标记；4）在染色体上不均匀分布，AFLP标记经常在着丝粒附近区域高度聚集AFLP标记技术的应用遗传连锁图谱的构建亲缘关系和遗传多样性的研究种质资源鉴定分子标记辅助选择育种基因表达和基因克隆谢谢