乳酸发酵与乳酸菌饮料的制备

生物科学与技术综合实验黄运红生物科学与技术综合实验实验一乳酸发酵与乳酸菌饮料的制备乳酸菌饮料是一种发酵型的酸性含乳饮料,通常以牛乳或乳粉、植物蛋白乳（粉）、果蔬菜汁或糖类为原料，经杀菌、冷却、接种乳酸菌发酵剂培养发酵，然后经稀释而成。一、酸奶的营养价值•1营养丰富，具有鲜乳所有的营养价值，而且优于鲜乳。•2调节人体肠道中的微生物菌群平衡，抑制肠道有害菌生长。•3降低胆固醇水平•4合成某些抗菌素，提高人体抗病能力。•5缓解“乳糖不耐受症”。•6有美容、润肤、明目、固齿等作用。二、酸乳的发酵剂菌种根据FAO关于酸乳的定义，酸乳中的特征菌为嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌。所谓发酵剂（starter）是指生产发酵乳制品时所用的特定微生物培养物。左图保加利亚乳杆菌，右图嗜热乳酸链球菌三、发酵剂的选择•1.产酸能力•2.后酸化•3.产香性•4.粘性物质的产生•5.蛋白质的水解性①感官评价②挥发性酸的量③乙醛生成能力①温度②pH③菌种与菌株④贮藏时间3.产香性•一般酸乳发酵剂产生的芳香物质为乙醛、丁二酮、丙酮和挥发性酸。①感官评价用常温;酸度不能过高;要新鲜，用生产24～48h内的酸乳②挥发性酸的量通过测定挥性酸的量来判断芳香物质的产生量③乙醛生成能力乙醛形成酸乳的典型风味，不同的菌株产生乙醛能力不同，因此乙醛生成能力是选择优良菌株的重要指标之一5.蛋白质的水解性•嗜热链球菌在乳中只表现很弱的蛋白水解活性，保加利亚乳杆菌则可表现较高的蛋白水解活性.影响蛋白质水解活性的因素①温度低温（如3℃冷藏）蛋白质水解活性低，常温下增②pHpH过高易积累蛋白质水解的中间产物，给产品带来苦味。③菌种与菌株嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的比例和数量会影响蛋白质的水解程度。④贮藏时间贮藏时间长短对蛋白质水解作用也有一定的影响。四、发酵剂的制备•1．培养基的热处理90～95℃30～45min•2．冷却至接种温度•3．加入发酵剂•4．培养培养时间一般为3～20h。•5．冷却10～20℃•6．贮存培养基：脱脂奶，或特级脱脂奶粉按9%～12%的干物质制成再制脱脂奶替代。以2.5%～3%的接种量和2～3h的培养时间，要达到球菌和杆菌1:1的比率，最适接种和培养温度为43℃。最适pH4.5。注意：接种量、培养温度和培养时间在所有阶段都必须保持不变！五、乳酸菌饮料的质量控制1．饮料中活菌数的控制•乳酸菌活性饮料要求每毫升饮料中含活的乳酸菌100万以上。2．沉淀•①均质•②稳定剂•③添加蔗糖•④有机酸的添加•⑤发酵乳的搅拌温度五、乳酸菌饮料的质量控制3.脂肪上浮4.杂菌污染主要杂菌：酵母菌、霉菌。五、乳酸菌饮料的质量控制六、发酵型酸性含乳饮料标准•感官指标•组织状态•理化指标•卫生指标色泽呈均匀一致的乳白色，稍带微黄色或相应的果类色泽。口感细腻、甜度适中、酸而不涩，具有该乳酸菌饮料应有的滋味和气味，无异味。呈乳浊状，均匀一致不分层，允许有少量沉淀，无气泡、无异味。应符合表1的规定应符合表2的规定表1酸性含乳饮料理化指标项目指标蛋白质（%）总固体（%）总糖（以蔗糖计）（%）酸度（ºT）砷（以As计）（mg/kg）铅（以Pb计）（mg/kg）铜（以Cu计）（mg/kg）脲酶试验食品添加剂≥0.7≥11≥1040～90≤0.5≤1.0≤5.0阴性按GB2760规定六、发酵型酸性含乳饮料标准表2酸性含乳饮料微生物指标项目指标活性乳酸菌饮料乳酸菌（cfu/ml）出厂销售菌落总数（cfu/ml）大肠菌群（MPN/100ml）霉菌总数（cfu/ml）酵母数（cfu/ml）致病菌（肠道致病菌及致病性球菌）≥1×104有活菌检出—≤3≤30≤50不得检出六、发酵型酸性含乳饮料标准七、技术路线乳酸菌的分离纯化乳酸菌的鉴定乳酸发酵及检测乳酸菌饮料的制备八、操作步骤1.乳酸菌的分离纯化(1)制备乳酸菌分离培养基蛋白胨10g；牛肉膏5g；酵母膏5g；乳糖5g；琼脂20g；葡萄糖10g；NaCl5g加入1000mL蒸馏水蒸馏水中加热溶解，pH值为6.8，在115℃，灭菌30分钟。八、操作步骤1.乳酸菌的分离纯化（2）倒平板（3）平板划线分离（4）培养(40℃，48小时)（5）观察实验结果（6）挑单菌落，转接斜面(培养40℃48小时)八、操作步骤2.乳酸菌的鉴定(2)选取乳酸菌典型菌落转至脱脂乳试管中(1)制备脱脂乳试管脱脂乳粉和水以1:10(W/V)的比例与5%蔗糖水为1:10的比例配制,装量为试管的1/3为宜,115℃灭菌30min.八、操作步骤2.乳酸菌的鉴定(3)培养40℃8-24h牛乳出现凝固，无气泡，呈酸性(4)革兰氏染色涂片，加二甲苯覆盖约一分钟，倾去，干燥后火焰固定，革兰氏染色，油镜观察八、操作步骤3.乳酸发酵及检测(1)制备乳酸菌培养基蛋白胨10g；牛肉膏5g；酵母膏5g；乳糖5g；琼脂9g；葡萄糖10g；NaCl5g加入1000mL蒸馏水中加热溶解，pH值为6.8，在115℃，灭菌30分钟。八、操作步骤3.乳酸发酵及检测(2)乳酸菌发酵与检测在无菌操作条件下，将菌种接入装有5ml乳酸菌培养基15x150的试管中，40℃培养箱中培养，培养24h后，每隔8h检测pH（在无菌操作条件下，用接种环取样，放入pH试纸上，比色，读结果），pH降到4结束，最后绘图。八、操作步骤4.乳酸菌饮料的制备（1）牛乳种子液的制备及灭菌（不做）制备60mL牛乳：将脱脂乳粉和水以1:8(W/V)的比例，同时加入5%蔗糖，充分混合，分装：用无菌的吸管取5mL牛乳装入普通的试管中（共计10支)灭菌：80-85℃灭菌15min八、操作步骤4.乳酸菌饮料的制备（2）种子液的制备（不做）接种：将分离获得的嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌各取一环接入巴氏消毒过的牛乳试管中，各五支，最后将试管置于40℃培养箱中培养，48h。计数：涂片，加二甲苯覆盖约一分钟，倾去，干燥后火焰固定，革兰氏染色，油镜观察。种子液：以数量大致相等牛乳试管作为种子液。八、操作步骤4.乳酸菌饮料的制备1．称量用电子天平称量脱脂乳粉12.5g和蔗糖5g；2．量取及灭菌先用100mL量筒量取100mL蒸馏水于250mL三角瓶中，包扎，然后置于高压灭菌锅中进行高压蒸汽灭菌，灭菌条件为121℃,15min。4．巴氏消毒将称量的脱脂乳粉和蔗糖分别倒入已灭菌的三角瓶，混合均匀，最后置于60-65℃水浴锅中，灭菌30min，冷却备用。（3）饮料基质的制备及灭菌八、操作步骤4.乳酸菌饮料的制备（4）接种在无菌操作条件下，用灭菌5mL移液管移取2.5mL酸奶（购买的品牌酸奶作为种子液）转入装有饮料基质的三角瓶中。（5）发酵在40℃培养箱中培养，24h（6）贮藏4℃冰箱贮藏，24h八、操作步骤4.乳酸菌饮料的制备（7）乳酸质量的评定参见六、发酵型酸性含乳饮料标准