微生物中的转座因子

第七章微生物中的转座因子转座因子（transposableelement）是一类广泛存在于细菌、病毒和真核生物DNA分子中一段可自主改变自身座位的DNA片段，它可以在同一细胞内DNA复制子间转移，也可以在一个复制子内部转移。转座因子的共同特征是：插入寄主DNA后，导致基因失活；插入时在靶DNA位点产生一个短的正向重复顺序。第一节细菌转座因子的类型和结构细菌转座因子分为四个类型：插入序列（insertionsequenceIS）转座子（transposonTn）接合型转座子转座噬菌体（Mu）一、插入序列插入序列也称IS因子，它是最简单的转座因子。插入序列长度/bp反向重复序列长度/bp靶位点长度/bp在染色体中的拷贝数IS1768239或86-10IS213274154-13IS31400383-45-6IS414281811或121-2IS5119516411-12插入序列的结构有以下3个特点：1.两端含有长度为10～40bp反向重复序列2.含有一个编码转座酶的长编码区3.两侧有一对正向重复序列(directrepeatsequence，DR)，长度一般为3-9bp。二、细菌转座子带有抗性基因并能在不同的DNA分子之间移动的遗传单位叫做细菌转座子(bacterialtransposon，Tn)。细菌抗药性转座子一般可分为两类：复合转座子(compositetransposon)复杂转座子(complextransposon)1.复合转座子转座子长度kb遗传标记末端特征末端两IS排向IS关系IS功能来源Tn109.3TetRIS10RIS10L反向2.5%差异完整功能功能减弱G-细菌Tn55.7KanRIS50RIS50L反向1bp差异完整功能无功能G-细菌Tn9033.1KanRIS903反向相同都有功能G-细菌Tn92.5CamRIS1同向相同都有功能G-细菌Tn16812.08胞外肠毒素IS1反向相同都有功能G-细菌复杂转座子的长度约5000bp，它的两端是长度为30-40bp的末端反向重复序列(IR)或正向重复序列(DR)，中央是转座酶基因和抗药性基因。2.复杂转座子(TnA转座子)Tn3res转座酶IRIR解离酶AmpIRIR转座酶解离酶resMerTn501IRIR转座酶解离酶resSulStrTn21转座子长度/bp遗传标记末端反向重复/bp两侧靶点正向重复/bp来源Tn15000Amp385假单胞菌Tn34957Amp385沙门氏菌Tn2119600MerStrSul385志贺菌Tn5018200Hg385假单胞菌Tn10005800无375大肠杆菌Tn5515300Em355金萄球菌Tn44304200无385苏云金菌Tn44516200Cam12不详荚膜梭菌Tn44566800无385弗氏链霉菌三、细菌转座子的插入机制、转座模型转座子不同于噬菌体和质粒，它们不是独立的复制子，不能独立存在。根据转座子在转座过程中是否复制而分为两种类型：复制型转座和非复制型转座据转座过程中是否有共整合体，可分为：剪-贴型转座、保守型转座和复制型转座1．剪-贴型转座（cutandpastetransponsition）1.转座子和靶DNA在转座酶作用下产生缺口，分别形成两个游离末端，以a-h表示2.a与f、g与d连接，剩下b、c、e、h游离端2．复制型转座子的插入机制3.以转座子的两个游离端（b和c）为引物进行DNA复制4.复制完成并形成两个转座子的共整合体5.两个转座子通过自身携带的res位点产生重组，形成两个独立的复制子，每个复制子上都含有一个拷贝的转座子。1.在复制型转座过程中，转座子被复制，一个拷贝仍保留在原来的位置上，另一个拷贝则插入到新的位点上，这种类型的转座伴随着转座子拷贝数的增加。2.在转座过程中有共整合体的出现。3.复制型转座涉及到两种类型的酶：一种是转座酶，它作用于原位点的转座因子的两端序列；另一种是解离酶（resolvase），它作用于复制拷贝的拆分。复制型转座的特点：3．保守型转座四、Mu噬菌体的转座转座噬菌体是具有转座功能的一类可引起突变的溶源性噬菌体。这类噬菌体不论是进入裂解循环还是处于溶源状态，均可整合到寄主染色体上。其中研究得较多的是Mu噬菌体。Mu噬菌体(mutatorphage)，即突变者的意思，不同于一般的温和噬菌体：1)MuDNA几乎可插入到宿主染色体的任何一个位点上，而一般的温和噬菌体在宿主染色体上有特定插入位点。2)Mu噬菌体DNA的两端没有黏性末端，它的整合方式不同于λ噬菌体，而类似于转座因子的作用cABCDEHFGITJKLMYNPRSUU’S’宿主DNA整合复制晚期mRNA合成激活因子头部和尾部基因可变化末端的宿主DNAlysattLattR1.Mu噬菌体的遗传图C蛋白表达A蛋白受抑制，维持溶原状态MuCts突变，受高温诱导进入裂解循环A、B蛋白大量表达，Mu复制晚期基因表达包装酶切割MuDNA包装50b37kb1kb2.Mu噬菌体的转座及其生活史五、细菌接合型转座子接合型转座的特点是：不具有反向重复序列，在转座时不引起靶位点DNA上核苷酸序列产生正向重复；转座过程中是通过“切除-插入”机制来完成的；在转移过程中，会形成共价、闭合、环状的中间体，在同一细胞中的不同DNA位点进行整合或通过接合作用进入受体细胞后整合到受体细胞的DNA上。第二节细菌转座因子的遗传效应和应用一、转座因子的遗传效应转座因子能引起许多遗传变异：1.插入突变由于Tn总是带有抗药性基因，所以转座子插入后除能引起基因突变外，还具有转座子带来的抗药性。2.DNA重排(缺失、倒位和扩增)abxyzcdabcdxyzabcdzyx同源序列配对重组缺失：abxyzcdabdcxyzabzyxcd同源序列配对重组倒位：abxyzcdxyzabxyzcdzyx同源序列配对重组扩增：3.极性效应当转座因子插入到一个操纵子的上游基因时，不仅能破坏被插入的基因，而且也能大大降低位于远离启动子一端的基因的表达。几乎所有IS的可阅读框内(除IS1外)，都含有依赖于Rho的转录终止信号和终止密码子，这是造成极性突变的根本原因。1.随机诱变转座子载体应具有下面两个功能：①能通过转化或接合作用导入受体菌②在受体菌中不能自我复制，为自杀型质粒载体二、转座子的应用GenomePrimingSystem(NEB)2.定位诱变定位诱变与随机诱变的原理类似，但诱变中首先需要将转座子，如Tn5，整合在基因组上。然后将要诱变的目的基因克隆到质粒如F质粒上。将含有目的基因的F′质粒转入基因组已整合有Tn5的大肠杆菌中，再与受体菌杂交进行诱变，最后筛选突变型接合子。F’Tn5(Kan)Δ(lacpro)F’lac+pro+Δ(lacpro)galEstrAXF’Δ(lacpro)galEstrAF’lac+pro+F’Tn5(Kan)Δ(lacpro)F’lac+pro+F’Tn5(Kan)Δ(lacpro)F’lac-pro+死亡死亡生长第三节丝状真菌中的转座因子一、丝状真菌中的转座现象真菌转座因子的鉴定方法：1.克隆真菌中的重复序列，然后与其他生物中的已知转座因子进行比较来确定。2.根据真菌的缺陷型表型来鉴定转座因子。3.通过同源杂交，即以别的生物中的转座因子为探针进行杂交筛选。4.通过DNA序列分析。二、丝状真菌中转座因子类型根据转座机理，可将丝状真菌的转座因子分为两大类：1.类似反转录病毒的反转座子2.类似于细菌转座因子的DNA转座子1.类似反转录病毒的反转座子根据反转座子的两端是否具有类似反转录病毒的长末端重复序列LTR而分为两种类型：a.LTR-反转座子b.非LTR-反转座子2.DNA转座子结构特征与细菌转座子类似，两端具有反向重复序列，中间有编码转座酶的ORF，在靶位点两端形成正向重复序列。第四节酵母中的转座因子1、转座因子分哪几类？它们之间有何异同？2、何谓复合转座子、复杂转座子？各有何特点？3、根据复制机制，将转座子分为哪几类？各有何特点？4、为什么说Mu噬菌体不同于一般的温和噬菌体？在应用中它与IS、Tn比较有何优点？5、何谓极性效应？引起极性效应的可能原因是什么？6、如何利用转座子进行随机诱变和定位诱变？7、简述三亲本杂交的原理和基本步骤？8、举例说明丝状真菌中转座因子的不同类型。本章思考题