理化因素对微生物的影响;细菌的生长现象与生化反应

•实验四理化因素对微生物的影响；细菌的生长现象与生化反应•基础部微生物学教研室[教学目标]1.了解细菌代谢产物的生化检查方法。2.熟悉常见的物理化学因素对细菌生长的影响。3.熟悉细菌对抗生素的敏感试验方法与步骤。4.掌握细菌在不同培养基中的生长现象。教学重点与难点：重点：细菌在不同培养基中的生长现象。难点：药敏试验的判断，细菌常见的代谢产物并分析其生化反应现象的意义【材料】血液琼脂平板培养基、灭菌棉拭、接种环、酒精灯。紫外线灯、2.5％碘酒、75％乙醇、1％龙胆紫、2％红汞、1:1000新洁尔灭、无菌滤纸片、葡萄球菌培养液、大肠埃希菌培养液、琼脂平板、无齿小镊子。抗生素纸片(青、链、氯、庆大霉素、磺胺等)。教学基本内容：一、观看录像：消毒灭菌二、讲解紫外线杀菌的原理，抗生素敏感实验的原理与操作三、操作讲解与示范：观察细菌在不同培养基中的生长现象。检查细菌常见的代谢产物并分析其生化反应现象的意义。四、学生动手操作一、观看录像：消毒灭菌二、消毒灭菌试验讲解紫外线杀菌的原理；抗生素敏感实验的原理与操作消毒与灭菌方法加热灭菌干热灭菌湿热灭菌过滤除菌辐射灭菌放射线辐照灭菌紫外线灭菌化学药品灭菌干热灭菌干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白蛋凝固就越快，反之含水量越少，凝固缓慢。因此，与湿热灭菌相比，干热灭菌所需温度要高（160～170℃），时间要长（1～2h），但干热灭菌温度不能超过180℃，否则，包器皿的纸或棉塞就会烧焦，甚至引起燃烧。微孔滤膜过滤除菌•过滤除菌是通过机械作用滤去液体或气体中细菌的方法。根据不同的需要选用不同的滤器和滤板材料。微孔滤膜过滤器是由上下二个分别具有出口和入口连接装置的塑料盖盒组成，出口处可连接针头，人口处可连接针筒，使用时将滤膜装入两塑料盖盒之间，旋紧盖盒，当溶液从针筒注入滤器时，此滤器将各种微生物阻留在微孔滤膜上面，从而达到除菌的目的。根据待除菌溶液量的多少，可选用不同大小的滤器。此法除菌的最大优点是可以不破坏溶液中各种物质的化学成分，但由于滤量有限，所以一般只适用于实验室中小量溶液的过滤除菌。（一）煮沸与高压灭菌法【原理】高温对细菌有明显的致死作用，主要机制是凝固菌体蛋白质，也可能与细菌DNA单螺旋断裂、细菌细胞膜功能受损及菌体内电解质浓缩有关。湿热灭菌法所需温度比干热法为低，时间较短。尤其是高压蒸气灭菌，因增加压力而提高沸点，灭菌效果最佳。有芽胞的细菌由于对热的抵抗力比无芽胞细菌强，所以只有采用高压蒸气灭菌法才能将芽胞彻底杀灭。•【材料】•琼脂平板两块、肉汤管两支、大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌肉汤培养物。•【方法】•①取琼脂平板两块，用记号笔分别在二平板底部玻面上，注明大肠埃希菌和枯草芽胞杆菌，并分别将二块平板底玻璃面划分三等份，于每块平板的三等份上分别注明对照、加热100℃10min及加热121℃20min。•②取肉汤管二支，分别注明加热100℃l0min及加热121℃20min，用毛细吸管吸取大肠埃希菌肉汤培养物，于上述二支肉汤管中各加入菌液一滴。混匀，再用接种环于二支肉汤管的任何一管中取一环菌液接种于大肠埃希菌平板的对照处，然后分别将肉汤管加热100℃l0min及加热121℃20min(高压蒸气15磅、20min)，再各取一接种环分别接种于平板的相应部位。枯草芽胞杆菌以同法试验。•③将二块琼脂平板接种物置37℃培养24小时，比较培养基上二种细菌的生长情况。•【结果观察】（填表）•表:煮沸和高压灭菌实验结果细菌名称100℃10分钟121℃20分钟未加热(对照)枯草芽胞杆菌大肠埃希菌（二）紫外线杀菌法【原理】波长265～266nm的紫外线因与DNA吸收光谱-致而有明显的杀菌作用。其机制是使细菌DNA相邻的胸腺嘧啶形成二聚体，从而破坏DNA构型，干扰其正常复制，导致细菌死亡。紫外线杀菌力虽强，但穿透力弱，故只能用于实验室、病房或手术室内空气及物体表面的消毒灭菌。另外，杀菌波长的紫外线对人体皮肤、眼睛等有损伤作用，应注意防护。【材料】大肠埃希菌培养物、琼脂平板、接种环、酒精灯、紫外线灯。【方法】①以灭菌接种环挑取大肠埃希菌培养物，于琼脂平板上作来回密集划线接种。②半启皿盖(将皿盖遮住涂面的1／2)，置于紫外线灯下lm以内接受照射30分钟。③盖上皿盖，于37℃培养24小时后观察结果。【结果观察】（填空）平板上用黑纸遮盖部分菌生长，未遮盖部分菌生长。这说明紫外线具有作用，但力弱。（三）化学消毒法1、皮肤消毒试验【原理】乙醇可使菌体蛋白脱水凝固或与菌体蛋白、酶蛋白等结合而使之变性失活。70％～75％乙醇在15～30秒即将细菌杀死。但95％的乙醇消毒效果反不如70％～75％为好，因高浓度乙醇使菌体蛋白表面迅速凝固，影响乙醇继续进入菌体内发挥作用。2.5％的碘酒可使菌体酶蛋白中的硫氢基(-SH)改变，使酶失去活性，导致机能障碍而死亡。【材料】普通琼脂平板一个、2.5％碘酒、75％乙醇。【方法】取普通琼脂平板一个，用蜡笔在平板背面玻璃上划成五等分，并贴上标签；两人用手在培养基上各涂一格，然后用2.5％碘酒、75％乙醇消毒手指后再各涂另一格，留一格作对照，盖好平板，置37℃温箱中培养24小时观察结果。【结果】（填表）皮肤消毒试验结果37℃24h培养细菌生长情况结果解释消毒前手指皮肤消毒后手指皮肤对照(不接种)•2、化学消毒剂对细菌的影响•【原理】•有些化学药品浓度高时能杀灭病原微生物，称为化学消毒剂；浓度低时能抑制细菌生长，称为防腐剂。由于化学消毒剂对人体细胞往往具有毒性作用，故只能外用。不同细菌对不同的化学消毒剂具有不同的敏感性。•【材料】•1％龙胆紫、2％碘酒、2％红汞、1:1000新洁尔灭、无菌滤纸片、葡萄球菌培养液、大肠埃希菌培养液、琼脂平板、无齿小镊子。•【方法】•取琼脂平板两块，分别在其底部注明葡萄球菌及大肠埃希菌。同时将每块平皿底部玻璃面划分4等分，并分别标明龙胆紫、碘酒、红汞、新洁尔灭。(操作方法与药敏试验相似)•三、抗生素的抗菌试验(药敏试验，纸片法)••【原理】抗生素主要是指某些微生物(大多数为放线菌和真菌、极少数为细菌)在生长繁殖过程中产生的一种合成代谢产物。此种有机化合物具有抗生物作用，能抑制或杀灭某些生物细胞，主要是一些微生物和肿瘤细胞。一种抗生素只对一定种类的生物细胞具有选择性拮抗作用，这种作用范围称为抗菌谱。抗生素的抗菌试验(药敏试验)是指在体外测定药物抑制或杀死细菌能力的试。为正确使用抗生素，临床上常在分离致病细菌的同时做药物敏感试验，以了解该细菌对常用各种抗生素的敏感性。提高治疗的针对性。同时，减少患者的痛苦，减轻病人的经济负担。药敏试验的常用方法：纸片法【方法】①取琼脂平板培养基二块，于其底部玻璃上用标签纸注明本人所接种的菌株名称（或将平板底部以蜡笔划为六等分，分别在靠近边缘处注明青、链、氯、庆大等字样）。•②以灭菌接种环挑取菌液，在培养基表面作密集划线接种。•③将镊子火焰灭菌，待冷后再取各药物纸片，分别牢贴于种有细菌的平板培养基表面相应位置，每次贴片后镊子均应经火焰烧灼灭菌。每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm，并分别作好标记。••••在直径90mm的平板上均匀摆放药敏纸片的样板••④37℃孵育18～24h后，分别测量各纸片抑菌环直径(包括纸片在内)(mm)，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限。判定其敏感度。•【材料】•①金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、琼脂平板培养基。•②抗生素纸片(青、链、氯、庆大霉素、磺胺等)、尖头镊子、酒精灯、接种环。•【方法】•①取琼脂平板培养基二块，于其底部玻璃上用标签纸注明本人所接种的菌株名称（或将平板底部以蜡笔划为六等分，分别在靠近边缘处注明青、链、氯、庆大等字样。•操作：•1）抗生素敏感试验（普通平板2块/3人）•2）抗生素纸片(青霉素、链霉素、庆大霉素、黄连素1套/6人)•3）大肠杆菌、敏感金葡菌培养物（1支/6人）药物敏感试验结果判断参考标准：抗菌药物抑菌圈直径（mm）耐药中度敏感敏感青霉素＜1010～12≥13链霉素＜1010～14≥15其它抗生素＜1010～15≥16•敏感：表示常规剂量的药物在体内所达到的浓度能抑制或杀灭待测菌；中度敏感：指提高测定药物的剂量或在该药物浓集部位，细菌生长可被抑制；耐药：表示常规剂量的药物在体内所达到的浓度不能抑制或杀灭待测菌。•【结果观察记录】填表药物敏感试验(纸片扩散法)结果抗生素大肠埃希菌金黄色葡萄球菌抑菌圈直径(cm)敏感度抑菌圈直径(cm)青霉素红霉素庆大霉素先锋霉素氯霉素思考题1.药敏实验的意义是什么？