第2章 沉淀分离法

本科课程第2章沉淀分离法一、概述二、分类三、常用的沉淀分离方法及试剂沉淀分离法(Separationbyprecipitation)沉淀分离法是在溶液中加入溶剂或沉淀剂,通过化学反应或者改变溶液的pH值、温度、压力等条件,使分离物以固相物质形式沉淀析出的一种方法。能否将分离物从溶液中析出,取决于分离物的溶解度或溶度积,关键在于选择适当的沉淀剂和控制条件,沉淀的目的在于通过沉淀使目标成分达到浓缩和去杂质,或是将已纯化的产品由液态变成固态。一、概述沉淀法是最古老、经典的化学分离方法。虽然，沉淀分离需经过过滤、洗涤等手续，操作较繁琐费时；某些组分的沉淀分离选择性较差，分离不完全。但由于应用范围广、不需特殊设备，沉淀分离法仍然是一种常用的分离方法。2、沉淀分离方法特点①沉淀的方法和技术应具有一定的选择性,才能使目标成分得到较好分离,纯度较高；②对于一些活性物质(如酶、蛋白质等)的沉淀分离,必须考虑沉淀方法对目标成分的活性和化学结构是否破坏；③对于食品和医药中的目标成分的沉淀分离,必须充分估量残留物对人体的危害.在应用沉淀分离技术时,需要考虑三种因素沉淀分离法分为：沉淀分离法和共沉淀分离法。两种方法的区别主要是：沉淀分离法主要使用于常量组分的分离（毫克数量级以上);共沉淀分离法主要使用于痕量组分的分离(小于1mg/mL).根据分离的对象不同，沉淀分离的方法和技术也有较大差异。因此，分为无机离子及化合物的分离和有机及生物化合物的分离两大类讨论。二、沉淀分离法的分类三、常用的沉淀分离方法及试剂（一）无机离子及化合物的分离1.氢氧化物沉淀分离2.硫化物沉淀分离3.共沉淀分离法4.常用无机沉淀剂5.常用有机沉淀剂6.常用无机共沉淀剂7.常用有机共沉淀剂表各种金属离子氢氧化物开始沉淀和沉淀完全时的pH值氢氧化物溶度积KSP开始沉淀时的pH值[M+]=0.01mol·L-1沉淀完全时的pH值[M+]=0.01mol·L-1Sn(OH)41×10-570.51.3TiO(OH)21×10-290.52.0Sn(OH)21×10-271.73.7Fe(OH)31×10-382.23.5Al(OH)31×10-324.15.4Cr(OH)31×10-314.65.9Zn(OH)21×10-176.58.5Fe(OH)21×10-157.59.5Ni(OH)21×10-186.48.4Mn(OH)21×10-138.810.8Mg(OH)21×10-119.611.6氢氧化物沉淀分离a.几种主要的沉淀剂及特点(1)NaOH溶液可使两性的氢氧化物溶解而于其他氢氧化物沉淀分离。(2)氨水加铵盐pH值为8－10，使高价离子沉淀而于一、二价的金属离子分离；另一方面Ag+,Cu2+,Co2+,Ni2+等离子因形成氨络离子留于溶液中。(3)ZnO悬浊液ZnO为一难溶碱，用水调成悬浊液，可在氢氧化物沉淀分离中用作沉淀剂。(4)有机碱、吡啶、苯胺、苯肼等有机碱，与其共轭酸组成缓冲溶液，可控制溶液的pH，使某些金属离子生成氢氧化物沉淀，达到沉淀分离的目的。氢氧化物沉淀分离1.金属氢氧化物沉淀的溶度积相差很大，通过控制酸度使某些金属离子相互分离。2.氢氧化物沉淀为胶体沉淀，共沉淀严重，影响分离效果。（1）采用“小体积”沉淀法——小体积、大浓度且有大量对测定没有干扰的盐存在下进行沉淀。如：在大量NaCl存在下，NaOH分离Al3+与Fe3+。（2）控制pH值选择合适的沉淀剂：不同金属形成氢氧化物的pH值、及介质不同。（3）采用均匀沉淀法或在较热、浓溶液中沉淀并且热溶液洗涤消除共沉淀。（4）加入掩蔽剂提高分离选择性b.氢氧化物沉淀分离的特点：c.影响金属氢氧化物沉淀pH值的因素（1）金属离子浓度：浓度越低，pH值就越高；图2.3金属离子浓度对数图pM（2）离子的本性：阳离子电荷越多，半径越小则极化作用越强，沉淀所需pH值较低；（3）同一周期，自左向右，阳离子电荷增加，极化作用增强，与OH-结合逐渐牢固，则阳离子沉淀时的pH值就逐渐降低。例如：Mg2+沉淀时的pH值为10.5，而Al3+则pH=4.2（4）不同价态金属离子生成氢氧化物或水合氧化物不同。c.影响金属氢氧化物沉淀pH值的因素原理能形成难溶硫化物沉淀的金属离子约有40余种，除碱金属和碱土金属的硫化物能溶于水外，重金属离子个分别在不同的酸度下形成硫化物沉淀。因此在某些情况下，利用硫化物进行沉淀分离还是有效的。H2S。H2S是二元弱酸，溶液中的[S2-]与溶液的酸度有关，随着[H+]的增加，[S2-]迅速的降低。因此，控制溶液的pH值，即可控制[S2-]，使不同溶解度的硫化物得以分离。2、硫化物沉淀分离沉淀剂：H2S约40余种金属离子可生成难溶硫化物沉淀；各种金属硫化物沉淀的溶解度相差较大；根据H2S的分布曲线，溶液中S2-的浓度与pH有关，控制溶液pH可控制分步沉淀。H2S有毒，气味难闻；选择性差。（1）硫化物的溶度积相差比较大的，通过控制溶液的酸度来控制硫离子浓度，而使金属离子相互分离。（2）硫化物沉淀分离的选择性不高。（3）硫化物沉淀大多是胶体，共沉淀现象比较严重，甚至还存在继沉淀现象。可以采用硫代乙酰胺在酸性或碱性溶液中水解进行均相沉淀。在酸性溶液中：CH3CSNH2+2H2O+H+===CH3COOH+H2S+NH4+在碱性溶液中：CH3CSNH2+3OH-===CH3COO-+S2-+NH3+H2O（4）适用于分离除去重金属（如Pb2+）2、硫化物沉淀分离的特点（二）有机试剂沉淀分离法特点：高选择性、高灵敏度；应用普遍；有机沉淀剂与金属离子生成的三种沉淀类型：1.螯合物沉淀8-羟基喹啉与Mg2+生成六元环结构的螯合物沉淀；在氨缓冲溶液中，可实现镁与碱金属及碱土金属的分离；2.缔合物沉淀痕量Zn2+的共沉淀；3.三元化合物提高选择性和灵敏度的一条途径；a定义：共沉淀分离法就是加入某种离子同沉淀剂生成沉淀作为载体（沉淀剂，将痕量组分定量地沉淀下来，然后将沉淀分离（溶解在少量溶剂中、灼烧等方法），以达到分离和富集的目的的一种分析方法。b沉淀剂要求（1）要求对欲富集的痕量组分回收率高。（2）要求共沉淀剂不干扰待富集组分的测定。四、共沉淀分离法1、常用无机共沉淀剂无机共沉淀剂1、吸附共沉淀剂吸附是在沉淀表面吸附和沉淀有共同离子的盐。Fe(OH)3:金属Cu中分离微量的AlPbS:富集微量的Cu2+2、混晶共沉淀剂两种化合物的晶型相同，离子半径相差在10%-15%以内产生混晶。钢中的铍，可以利用BaSO4形成混晶富集。SrSO4生成混晶以富集食物中的痕量Pb2+，Fe3+、Cd2+、Co2+等离子不干扰。（选择性好）3、形成晶核的共沉淀剂（极微量离子）4、沉淀的转化作用（溶液中微量的Cu2+，CdS滤纸)2、常用有机共沉淀剂有机及生物化合物的分离1.溶剂沉淀2.盐析沉淀3.沉淀剂沉淀溶剂沉淀在有机化合物(如蛋白质、酶、多糖、核酸等)水溶液中加入有机溶剂(如乙醇、丙酮等)后,显著降低待分离物质的溶解度从而将其沉淀析出的一种方法。机理在于溶质(待分离物质)在溶液中化学势发生变化造成溶解度的下降。优点在于选择性好、分辨率高,因为一种有机化合物往往只能在某一溶剂狭窄的浓度范围内沉淀,溶剂易除去易回收,但条件控制不当容易使待分离物质(如蛋白质)变性。1、溶剂沉淀选择合适的溶剂是溶剂沉淀的关键,溶剂必须是能与水相混溶的有机溶剂,如甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、乙醚、石油醚、二甲基亚砜、己烷、四氢呋喃等。其中乙醇最为常用,能沉淀蛋白质、核酸、核苷酸、多糖、果胶和氨基酸等化合物,且安全性最高。同时,不同的有机化合物沉淀所需要的溶剂浓度有不同要求,使用不同浓度的同一种溶剂,往往可以在混合溶液中起到分级沉淀的效果。1).溶剂的选择及其添加量对于蛋白质样品溶液的沉淀分离,如果样品浓度低一些,可以减少蛋白质之间的相互作用,防止共沉淀现象,但易引起蛋白变性,另一方面,如果样品浓度高一些,可以减少蛋白变性,有机溶剂的使用量也可减少,但控制不当易出现共沉淀现象,一般而言,控制蛋白质起始浓度为5-0mg/mL。2).样品浓度的确定对蛋白质溶液进行溶剂沉淀分离,一般在低温条件下进行,大多数酶和蛋白质的溶解度随温度降低而降低,可以利用温度差进行蛋白质分级沉淀。如果温度过高,促使蛋白质的分子结构松散,使得溶剂分子与一些氨基酸残基产生疏水性结合而引起蛋白质的不可逆变性。3).温度的调节蛋白质溶液中的溶质溶解度受pH值影响,一般在等电点的溶解度最低,将pH值调节到溶液中多数蛋白质带有相同的净电荷,可减少蛋白质之间的相互作用,防止共沉淀。利用改变溶液的pH值可实现有选择的分段沉淀,另外,pH值与离子强度有协同作用而改变蛋白质的溶解度。4).pH值的调节低浓度的中性盐类增加蛋白质在有机溶剂中的溶解度,并且对蛋白质具有保护作用,防止变性。要将蛋白质从低离子强度的溶液中沉淀出来往往需要更高的溶剂浓度。5).离子强度的调节在较低浓度的盐溶液中,酶和蛋白质的溶解度随盐浓度升高而增大,这称之为盐溶;当盐浓度增大至一定程度后,酶和蛋白质的溶解度又开始下降直至沉淀析出,这称之为盐析。原理在于中性盐离子对蛋白质分子表面活性基团及水活度的影响结果。2.盐析沉淀蛋白质分子的表面特性蛋白质是两性高分子电解质，由疏水性不同的20多种氨基酸组成。在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，使亲水性氨基酸残基分布在蛋白质立体结构的外表面。但是，仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成硫水区。因此，蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成的荷电区、亲水区和硫水区构成。产生“盐析”（Saltingout）的原因盐离子与蛋白质表面具有相反电性的离子基团结合，形成离子对，使其分子之间电排斥作用减弱而相互聚集，靠拢。中性盐的亲水性比蛋白质大，盐离子在水中发生水化而使蛋白质脱去水化膜，暴露出疏水区，由于疏水区的相互作用，使其沉淀。纯一单蛋白质有公式：lgS=β－kS×IS为蛋白质溶解度（g/L）；β为I=0时lgS，它取决于溶质的性质；kS为盐析常数，主要决定于加入盐的性质及Pr性质。I为盐离子强度（mol/L）盐析的讨论㈠.单一纯蛋白质的盐析1．在一定的pH和温度下，改变离子强度－kS盐析法盐、Pr一定，kS值一定，I↑则S↓2．在一定的离子强度下，改变pH和温度－β盐析法β—pH：在Pr的pI时其溶解度较小β—温度：在保证Pr不变性下，温度↑β↓利于盐析。3．原始浓度PP小盐析所需I高，P大盐析所需I低对混合Pr的盐析，P大，会发生严重共沉作用，一般控制浓度为2.5-3%。㈡.混合Pr的盐析1．合适盐析范围的选择：不同Pr盐析峰有重叠，须权衡纯度回收率。2．改变原始浓度：一种蛋白质的不同浓度的沉淀曲线会变化。3．二次盐析：在原盐浓度下二次盐析，可除去易溶杂质，但不能除去难溶杂质。盐析操作要点1．盐的种类及选择可使用的中性盐有：(NH4)2SO4、Na2SO4、MgSO4、NaClNaAc、Na3PO4柠檬酸钠和硫氰化钾等，(NH4)2SO4、Na2SO4最广泛，前者最受欢迎2．盐析范围的确定可采用盐浓度对蛋白质沉淀量的盐析曲线测得。（从回收率和纯度考虑）3．盐的加入方式固体缓慢加，防泡沫，要平衡。液体（饱和盐溶液）要求盐析范围小于50%饱和度取一份小样分段盐析，从回收率和纯度考虑来确定范围4.Pr的原始浓度太稀的蛋白质溶液，不仅消耗大量中性盐，对Pr回收也有影响；高浓度可节约盐用量，但须适中，以避免共沉。盐析操作的其他方法1．透析盐析将Pr溶液盛于透析袋中，放入一定浓度的盐溶液中，由于渗透压的作用，袋中盐浓度连续性变化，使Pr↓2．反抽提法（Back-Extraction）将包括要分离的Pr在内的多种Pr一起沉淀出来，然后选择适当的递减浓度的硫酸铵来抽提沉淀物。影响盐析的因素1.溶质（蛋白质等）种类不同溶质的kS和β均不相同，所需的离子强度也不同。2.溶质（蛋白质等）浓度蛋白质浓度大时，中性盐的极限沉淀浓度低，共沉作用强，分辨率低，但用盐量少，