正交设计优化活菌型乳清饮料

1韩山师范学院学生毕业论文（2010届）韩山师范学院教务处制题目（中文）正交设计优化活菌型乳清饮料工艺（英文）Tooptimizethetechnologyofviabletypewheydrinkbyorthogonaldesign******************************专业:生物科学班级:20062312班姓名:林锦彬学号:2006231206系别:生物系指导老师:李云(讲师)2诚信声明我声明，所呈交的毕业论文是本人在老师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我查证，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，我承诺，论文中的所有内容均真实、可信。毕业论文作者签名:签名日期:年月日3摘要：活菌型乳清饮料是利用乳清作主要原料，添加乳酸菌发酵到一定程度，以降低乳糖，产生乳酸，最后生成的一种营养丰富的乳清饮料。乳清发酵过程受菌种比例、发酵温度、乳清浓度、接种量四种因子的影响。本实验应用正交设计的方法优化发酵乳清饮料的四个影响因子，结果表明，用乳酸菌发酵乳清饮料的最佳工艺条件为:菌种比例L.b:S.t:L.a=1:2:1，发酵温度为42℃，接种量为7%，乳清浓度5%。关键词：乳清；正交设计法；益生菌；发酵饮料4Abstract:Theviabletypewheydrinkisusewheyasthemainrawmaterialaddinglactic,addinglacticacidbacteriafermentedtoacertainextent,toreducethelactose,producelacticacid,andfinallygenerateanutrient-richwheydrinks.Theprocessofwheyfermentationaffectedbyfourfactorswhichisstrainratio,fermentationtemperature,wheyconcentrationandinoculum.Theexperimenttooptimizefourfactorswhichaffecttheprocessofwheyfermentationbyorthogonaldesign.Theresultsshowedthatthebesttechnologicalconditionsofthebeverageofwheyfermentedbylacticacidbacteriawas:StrainratioofL.b:S.t:L.a=1:2:1,fermentationtemperatureof42℃,inoculationof7%,wheyconcentrationof5%.KeyWords:Whey;Orthogonaldesign;Probiotics;Fermentedbeverages5目录1材料和方法……………………………………………………………………21.1材料……………………………………………………………………………21.2菌种……………………………………………………………………………21.3培养基…………………………………………………………………………21.4主要试剂………………………………………………………………………21.5仪器和设备……………………………………………………………………31.6方法……………………………………………………………………………32结果与分析……………………………………………………………………62.1乳清饮料发酵条件的优化结果与分析………………………………………62.2验证实验结果…………………………………………………………………93讨论……………………………………………………………………………104参考文献………………………………………………………………………115致谢……………………………………………………………………………121正交设计优化活菌型乳清饮料工艺乳清(whey)是乳经酸凝乳或凝乳酶凝固后剩余的液态部分，是干酪和干酪素生产的副产物，呈黄绿色[1]。一般每生产1kg干酪可得到9kg乳清，每生产1kg干酪素可得27kg乳清[2]。据FAO数据统计[3]，在近五年里，全球干酪产量增长了近150万吨，目前的生产量约1810万吨。而乳清营养则相当于除去酪蛋白的脱脂乳，其营养物质占原料乳的55%，干物质约占6-8%，粗蛋白占1%，粗脂肪占0.3-0.4%，总糖(乳糖约99.8%)占3-5%，还有多种矿物质和水溶性维生素等[4，5]。乳清的多种营养成分具有重要生理功用，如乳清蛋白是一种高营养优质蛋白质。乳清蛋白中的必需氨基酸非常丰富，其含量等于或大于FAO/WHO提出的对幼儿和成人的推荐值，因此对个体健康具有重要意义。乳清中的糖类几乎都是乳糖，乳糖不仅可为机体提供能量，尚有多种营养与保健功能。另外乳清矿物质处于良好的平衡状态，其中钾和钠的比例为2∶1，具有完全的营养功效。发酵型乳清饮料[9]是利用营养价值极丰富的乳清作主要原料，添加乳酸菌发酵到一定程度，乳清中的乳糖经β-半乳糖苷酶的作用，转化成高甜度的葡萄糖-半乳糖糖浆，以降低乳糖，产生乳酸，最后生成一种口味纯正、酸甜可口、营养丰富的高档饮料。因此发展研制乳清饮料，既可充分利用乳清资源，又具有比其他利用方式(乳清粉、乳清蛋白粉等)工艺简单，投资设备少，产量大，经济效益高等特点，故是乳清利用的一个重要方向。澳大利亚是将乳清加工成果汁饮料；日本是先用酸性蛋白酶制取透明乳清，然后加入甜味料和着色剂等物质制成充气饮料；美国是先将乳清制成糖浆，再与葡萄汁配制成“葡萄酒”，其风味相当于标准葡萄酒[10]。国内对乳清饮料的研究也有报道，内蒙古农牧学院的孙天松等人[6]研制了澄清发酵饮料，找到了乳清发酵时的pH值、酸度随时间的变化关系；东北农学院的万贤生[7]作了利用微生物生产乳清饮料的研究；内蒙古农牧学院食品工程系的张和平等人[8]作了酶法多肽乳清饮料的研究。国外对乳清利用的研究，饮料形式较其他形式相对较少，归纳起来，有以下几种情况：①直接调配，即取一部分乳清、一部分果汁或其他原料进行调配而成；②制作蛋白澄清饮料，即通过酸化或加热等方法使蛋白质沉淀后再加工成饮料；③发酵型乳清饮料。其中第二种形式研究的比较多。正交试验设计(Orthogonalexperimentaldesign)是研究多因素多水平的一种设计方法，它是根据正交性从全面试验中挑选出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了“均匀分散，齐整可比”的特点，正交试验设计是分式析因设计的主要方法。是一种高效率、快速、经济的实验设计方法。日本著名的统计学家田口玄一将正交试验选择的水平组合列成表格，称为正交表。例如作一个三因素三水平的实验，按全面实验要求，需进行33=27种组合的实验，且尚未考虑每一组合的重复数。若按L9(33)正交表2安排实验，只需作9次，按L18(37)正交表进行18次实验，显然大大减少了工作量。因而正交实验设计在很多领域的研究中已经得到广泛应用。正交表的符号：Ln(ji)，其中L代表正交表的符号，n代表正交表的行数(试验次数，试验方案数)，j代表正交表中的数码(因素的水平数)，i代表正交表的列数(试验因素的个数)。通过前面对活菌型乳清饮料进行的单因素研究，我们知道菌种比例、发酵温度、乳清浓度、接种量等因子对活菌型乳清饮料的发酵都有一定的影响；且发酵活菌型乳清饮料的最佳菌种比例为：保加利亚乳杆菌:嗜热链球菌:干酪乳杆菌:嗜酸乳杆菌=1:2:1:1，最佳发酵温度为38℃；最佳乳清培养浓度4%；最佳接种量为7%。在此基础上活菌型乳清饮料的理化性质和风味都较好。结合单因素实验结果，本实验应用正交试验设计的方法优化发酵乳清饮料的四种影响因素:接种量、发酵温度、乳清浓度和菌种比例，确定最佳的工艺条件，以更好的满足理论研究和工业生产的需要。1材料和方法1.1材料市售脱脂奶粉D90脱盐乳清粉为荷兰进口（乳糖含量82%），酵母粉、胰蛋白胨、牛肉膏为生化试剂，其他试剂为分析纯。1.2菌种保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus，简写为L.b)、嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus，简写为S.t）、嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus，简写为L.a)、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei，简写为L.c）1.3培养基脱脂乳培养基：脱脂奶粉100g，蒸馏水1L，自然pH值，用于菌种的保藏活化。MRS液体培养基：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，葡萄糖20.0g，吐温-801.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，硫酸锰0.25g，硫酸镁0.58g，加蒸馏水至1000mL。调酸度至pH值为6.2-6.8，压力为0.07MPa，灭菌20min备用。MRS固体培养基则另加1.5%的琼脂。乳清培养基：乳清粉，水；按试验所需比例配制1.4主要试剂标准乳糖糖溶液：取分析纯乳糖置于105℃烘箱干燥2h，精确称取20mg溶解后置于100mL容量瓶内，用蒸馏水定容至刻度，配成0.2mg/mL的标准乳糖溶液。邻甲基苯胺试剂：称取硼酸0.65g溶于温热的210mL冰醋酸中，再加入1.25g硫脲，充分溶解后加入邻甲基苯胺37.5mL，用冰醋酸定容至250mL，贮于棕色瓶内。336％中性甲醛：用酚酞指示剂，将甲醛用氢氧化钠中和至刚出现粉红色为止。酚酞指示液：称取0.5g酚酞，用少量乙醇溶解并定容至500mL0.02mol/L氢氧化钠标准溶液氢氧化钠标准滴定溶液NaOH=0.1mo1/L：分析纯75%乙醇1.5仪器和设备立式万用电炉上海浦东荣丰科学仪器有限公司Spx-250B-G微电脑光照培养箱上海博讯实业有限公司医疗设备101A-1型电热鼓风干燥箱上海市实验仪器总厂HH-2数显恒温水浴锅潮州凯普生物仪器有限公司PHS-3DpH计上海精密科学仪器有限公司JY2502电子分析天平上海精密科学仪器有限公司LDZX-501LB立式压力蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂SW-CJ-16μ双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司BCD-222E4型冰箱TCL集团股份有限公司1.6方法1.6.1正交实验设计主要影响因素为接种量、发酵温度、菌种比例、乳清浓度,采用4因素3水平的正交表L9(34),各因素和水平的选取如表1所示。表1乳清发酵液正交试验因素水平Table1Wheyfermentationfactorlevelorthogonal因素及水平菌种比例（A）发酵温度（B）乳清浓度（C）接种量（D）11:2:1（L.b:S.t:L.c）35℃3%5%21:2:1（L.b:S.t:L.a）38℃4%7%31:2:1:1(L.b:S.t:L.a:L.c)42℃5%9%表2乳清发酵饮料配比方案正交实验计划表Table2Wheyfermentedbeveragesorthogonalmatchingprogramschedule试验号菌种比例（A）发酵温度（B）乳清浓度（C）接种量（D）11:2:1（L.b:S.t:L.c）35℃3%5%21:2:1（L.b:S.t:L.c）38℃4%7%31:2:1（L.b:S.t:L.c）42℃5%9%41:2:1（L.b:S.t:L.a）35℃4%9%51:2:1（L.b:S.t:L.a）38℃5%5%61:2:1（L.b:S.t:L.a）42℃3%7%471:2:1:1(L.b:S.t:L.a:L.c)35℃5%7%81:2:1:1(L.b:S.t:L.a:L.c)38℃3%9%91:2:1:1(L.b:S.t:L.a:L.c)42℃4%5%按上述正交实验设计计划表进行发酵试验。1.6.2理化指标的测定1.6.2.1pH值测定[11]用pHS-3D型pH计直接测定发酵后的pH值1.6.2.2活菌数测定[12]用稀释平板菌落计数法测定发酵后的活菌数在无菌条件下