感染性疾病的分子诊断20110418

1基因病的分子诊断Moleculardiagnosisforgenicdiseases2基因病概念1975年，Dulbecco提出：人类的DNA序列是人类的真谛，包括癌症在内的人类疾病的发生都与基因直接或间接有关1978年，SusumuTinegawa：从人类所有的疾病都与基因受损有关的角度出发，提出了人类疾病新概念——基因病（genicdisease）3基因病单基因病（monogenicdiseases）多基因病（polygenticdiseases）获得性基因病（acquiredgeneticdisease）孟德尔遗传性疾病，诸如：白化病、早老症、血红蛋白病、甲型血友病、囊性纤维化病、脆性X综合征等感染性疾病，诸如：HBV、HCV、HIV、HPV等复杂性（多因素）疾病，诸如：肿瘤、心脑血管疾病、代谢病、神经系统疾病、自身免疫性疾病等等4中国：引起死亡的主要疾病89.1%91.6%5基因病的分子诊断诊断分子（标志物）核酸蛋白质多糖类代谢物（生物小分子）激素代谢产物诊断技术分子杂交PCR测序芯片光谱色谱质谱核磁共振传感器6基因病的分子诊断技术基于核酸的分子诊断技术bDNAPCRPCR类型：巢式PCR，等温PCR，……定性PCRPCR产物＋RE酶切→电泳PCR产物＋RE酶切→杂交定量PCRFQ-PCR（real-timePCR）印迹：Southern/NorthernblotChip：micro-array测序技术（sequencing）7支链DNA技术（branchedDNA,bDNA）bDNA技术为一种核酸探针杂交标记信号放大技术特点：不经过呈指数增长的扩增过程，放大倍数确定，不利因素少，因此稳定性、重复性高，结果准确。操作简便：只需将待测病毒裂解释放出核酸，并将其变性为单链，即可进行检测，不需事先纯化缺点：就是放大倍数少、敏感性低、检测范围窄，不适用于低水平检测。第一代bDNA技术的检测范围3.5×105~5.7×107copies/ml第二代bDNA技术的敏感性有所提高，可2×105copies/ml8基因病的分子诊断技术基于蛋白质的分子诊断技术ELISA（酶联免疫吸附分析）ChipWesternblot2D电泳质谱飞行时间质谱（TOF）LC-Mass，GC-Mass核磁共振（NMR）质荷比（M/Z）与离子的飞行时间成正比HPLCUPLC分离9基因病的分子诊断技术基于代谢组学的分子诊断技术质谱核磁共振光谱色谱10第十章感染性疾病的分子诊断Moleculardiagnosisforinfectiousdiseases11感染的慨念感染是病原体和人体之间的相互作用过程病原体：衣原体、螺旋体、病毒、细菌、真菌、原虫、寄生虫病原微生物：致病菌（条件致病菌）微生物人体微生物人体不同的感染状态共生状态在正常情况下，人体的一些腔道和体表均有微生物寄生12感染后果（转归）病原体被清除------通过非特异性或特异性免疫隐性感染------是感染过程中最常见的类型显性感染（临床感染）------感染致病，慢性感染引起炎症潜伏性感染潜伏感染期间，病原体一般不排出体外病原携带状态------可以没有临床症状，而能排出病原体带病原体的种类不同：带病毒者、带菌者与带虫者不同携带状态潜伏期携带者、健康携带者、急性与慢性携带者是很多传染病的重要传染源13感染性疾病的分子诊断策略一般性策略（检出病原体）：判断有无感染是何种病原体感染常用方法：PCR＋杂交完整性策略：检出病原体分型（分类）－亚型－耐药性常用方法：杂交、PCR、基因芯片、DNA测序14感染性疾病分子诊断标志物病原体核酸分子（DNA/RNA）基因表达产物代谢物免疫应答分子细胞免疫体液免疫TT致敏T细胞淋巴因子B浆细胞IgMIgGIgAIgDIgE感染早期出现临近恢复期出现与原虫和蠕虫感染有关15定性或定量检测病原体的核酸，已经用于病毒、细菌和寄生虫感染的诊断动态、定量地检测病原体核酸，能对疗效判断和病情预后评价提供客观的依据感染性疾病的分子诊断临床价值16第一节病毒的基因检测17病毒核衣壳（nucleocapsid）包膜（envelope）刺突（spike）核酸（nucleicacid）DNAorRNA衣壳（capsid）衣壳粒核酸蛋白质衣壳第一节病毒的基因检测18检测病毒的方法血清学检测病毒分离鉴定（诊断的金标准）PCR技术（检出率最高）第一节病毒的基因检测19乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus,HBV）全世界有3.5亿慢性携带者，75%在亚太地区每年有一百万人死于HBV感染，是全球范围内第9位死因中国：50%~70%的人受过感染，8%~10%是HBV携带者世界其它地区亚太地区75%75%的长期慢性携带者来自亚太地区第一节病毒的基因检测20第一节病毒的基因检测HBV的形态特征DNA病毒双链（非环状）DNA不等长正链（2/3）负链HBV外膜携带的HBsAg抗原性有一个属特异性的抗原决定簇“a”和至少两个亚型决定簇“d/y”和“w/r”（尚有少见的q、g、n、x和t等亚型决定簇）最常见的血清型为adw、adr和ayw亚型的地区分布不同，我国以adr为主，adw次之，而ayw见于新疆、西藏和内蒙古等地21HBV在肝细胞内的复制A(n)mRNAcccDNAHBsAg包膜负链DNA包裹后的前基因mRNA传染性HBV病毒颗粒传染性HBV病毒颗粒部分双链DNA逆转录酶DNA聚合酶肝细胞第一节病毒的基因检测22HBV基因组结构pre-S1pre-S1蛋白pre-S2pre-S2蛋白SHBsAgpre-CHBeAgCHBcAgPDNAPXHBxAg编码HBsAgpre-S2pre-S1S区C区P区X区第一节病毒的基因检测基因重叠23急性感染时期HBV的标志物第一节病毒的基因检测HBV检测窗口期血清学（HBsAg）：56天PCR：33天缩短23天（平均6-15天）24HBV基因分型HBV基因序列差异的多少，可将HBV划分为不同的基因型，至今为止已发现A、B、C、D、E、F、G、H共8种基因型：A型主要存在于白人，B型和C型主要存在于亚洲人群E型主要存在于西非F型仅见于中南美洲的土著人G型和H型很少见不同基因型序列长度不同，主要是前S1区的不同。我国流行的主要是B和C基因型，长江以北以C型为主，长江以南以B型为主，另又少量的A型、D型和混合型。西北和西南尤其是西北有较高比例的D型第一节病毒的基因检测25第一节病毒的基因检测HBV分子诊断方法扩增位置引物序列扩增片段大小(bp)P、X基因特异片段5’-ATACTGCGGAACTCCTAGC-3’2785’-CCGCGTAAAGAGAGGTGCG-3’Ｃ基因特异片段5’-ATACCACAGAGTCTAGACTCGTGGTGGACT-3’4775’-AAGCCCTACGAACCACTGAACAAATGGCAC-3’Ｃ基因特异片段5’-GCTTTGGGGCATGGACATTGACCCCTATAA-3’2585’-ATGGGATCCCTGGATGCTGGGTCTTCCAAA-3’HBVDNA检测（PCR）PCR引物是PCR扩增的关键，决定扩增的特异性和敏感度。PCR引物常根据其S、C、P和X基因中的高度保守序列来设计。部分常用的引物序列261．样本处理（样本处理区）2．核酸扩增2.1试剂配置（PCR前准备区）2.2加样（样本处理区）2.3PCR扩增（检测区）HBVDNAFQ-PCR（realtimePCR）第一节病毒的基因检测试剂制备标本处理扩增检测xxx27HBVDNAFQ-PCR（realtimePCR）1．样本处理（样本处理区）样本100ul（待测血清或血浆，试剂盒中对照品）0.5ml离心管中→加入100ulDNA提取液1，振荡混匀13,000rpm离心10min；吸弃上清[离心时注意固定离心管方向、尽可能吸弃上清且不碰沉淀]再加入25ulDNA提取液2，振荡10sec[沉淀需打散、混匀]2,000rpm离心10sec，100℃干浴或沸水浴10min13,000rpm离心10min，保留上清备用.（如果样本裂解产物当天不使用，则要保存在-20℃）第一节病毒的基因检测28HBVDNAFQ-PCR（realtimePCR）2．核酸扩增2.1试剂配置（PCR前准备区）从试剂盒中提取出HBVPCR反应液、Tap酶及UNG，室温融化后，2000rpm离心10sec设所需的管数为n（n=样本数+2管阴性对照+1管强阳性对照+1管临界阳性对照+4管阳性参控品）每个测试反应体系配制如下表：计算好各试剂的用量，加入一适当体积试管中，充分混合均匀，向设定的n个Roche毛细管中分别加入18ul，转移至样本处理区第一节病毒的基因检测试剂PCR反应液Taq酶UNG用量17.8ul0.2ul0.03ul29HBVDNAFQ-PCR（realtimePCR）2.2加样（样本处理区）若样本（及对照品裂解产物）保存在-20℃，使用前置室温解冻，以13,000rpm离心5min在所设定的n个Roche毛细管中分别加入步骤1中处理过的样本、阴性对照、强阳性对照和临界阳性对照上清液以及阳性参控品各2ul（其中阴性对照做2管），盖紧管盖，连同Roche专用金属反应管套放在离心机中于2,000rpm离心5sec将毛细管排好放入RochePCR仪内，记录样本摆放顺序第一节病毒的基因检测30HBVDNAFQ-PCR（realtimePCR）2.3PCR扩增（检测区）2.3.1循环条件设置2.3.2仪器检测通道选择选择F1通道第一节病毒的基因检测ProgramCyclesTemperature(℃)IncubationTime(min:sec)TemperatureTransitionRate(℃/sec)AcquisitonModeAnalysisMode11373:0020NoneNone21921:0020NoneNone34092520NoneQuantification603020Single4140020NoneNone31HBVDNAFQ-PCR（realtimePCR）结果分析条件设定选F1或F1/F2通道，点击Quantification进入定量分析窗口；在Quantification窗口中，设定Analysis方式为FitpointsAdjustment方式为Arithmetic；选定Noiseband项，阈值（Noisebandcursor）设定以刚好超过正常阴性对照品扩增曲线（无规则的噪音线）的最高点，且Ct值不出现任何数值为准，也可根据仪器的实际情况进行调整第一节病毒的基因检测32HBVDNAFQ-PCR（realtimePCR）检测质控标准：四个阳性参控品的Ct值都应小于38.0，将阳性参控品1-4的拷贝浓度输入，仪器将自动以阳性参控品拷贝浓度的对数值为横坐标，以其实际测得的Ct值为纵坐标给出标准曲线，标准曲线的拟和度应小于等于-0.980，否则视为定量结果无效两个阴性对照的Ct值应无数值，HBVDNA拷贝数应为0copies/ml；强阳性对照的Ct值应小于等于30.0，HBVDNA拷贝数应为1×105-1×107copies/ml临界阳性对照的HBVDNA拷贝数应为1×103-9×104copies/ml，Ct值大于强阳性对照的Ct值，并小于等于38.0，否则实验视为无效第一节病毒的基因检测33HBVDNAFQ-PCR（real-timePCR）结果判断：FQ-PCR进行HBVDNA的定量检测，检测范围为2.5×102~2.5×109copies/ml检测样本中5×102copies/ml≤HBVDNA≤5×107copies/ml，测定结果有效，可直接报告相应的拷贝数检测样本中HBV