第3章-细胞生物学研究方法

第三章细胞生物学研究方法1．细胞形态的结构结构的观察方法2．细胞及其组分的分离、显示鉴定及定量技术3．细胞体外操纵技术知识点：第一节细胞形态结构和观察方法•细胞的形态观察细胞的大小和计量单位鸵鸟卵=12-15cm人卵细胞=0.1mm多数细胞=10-30μm血细胞=7μm显微镜观察范围肉眼观察范围显微镜观察范围&肉眼观察范围细胞生物学及成像技术发展史17世纪中叶的滑竿显微镜荷兰眼镜商ZacchariasJanssen制造的第一台复合式显微镜RobertHooke于1670年制造的显微镜现代显微镜•简洁紧凑的设计节省了镜座占用空间•人机工程学设计，操作简单•方便地安装各种CCD数码成像装置•出色的光学性能与系统的优良品质•最新的UIS2光学系统赋予显微图像前所未有的优异对比度价格：几万至几十万元！！一.光学显微镜技术体式光学显微镜光学显微镜（一）普通复式光学显微镜技术目镜光学放大系统物镜光源1.组成照明系统折光镜聚光镜机械和支架系统光学显微镜的成像原理•使用两个凸透镜，一个凸透镜把另外一个所成的像进一步放大，这就是复合式显微镜的基本原理。如果两个凸透镜一个能放大10倍，另一个能放大20倍，那么整个镜片组合的放大倍数就是10×20=200倍。复合显微镜中通常有两级串联放大系统，一级为物镜，另一级为目镜。2.分辨率：能够区别开的两个物点之间的距离0.61λD=N.Sin(/2)最大分辨率=0.2μmN=1,λmin=450nm,=140→D=0.3um3.制样方法固定、脱水、包埋、切片、染色、观察正置光学显微镜倒置显微镜光路系统正置显微镜与倒置显微镜光路比较（二）荧光显微技术什么是荧光?•物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。•显微镜荧光利用光源激发——光化荧光•Specimenabsorbslightatonewavelength(theexcitationwavelength)andemitslight(fluoresces)ataspecificandlongerwavelength.Mostfluorescentdyesemitvisiblelight.将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光素技术。免疫荧光技术RevealingSpecificProteinsinFixedCellsRevealingSpecificProteinsinLivingCellsDeterminingtheIntracellularConcentrationofCa2+andH+IonsThefluorescentpropertiesofcertaindyes,suchasfura-2,facilitatemeasurementoftheconcentrationoffreeCa2+inthecytosol.（三）激光扫描共聚焦显微镜技术价格：几百万元！！！传统的光学显微镜使用的是场光源，标本上每一点的图像都会受到邻近点的衍射或散射光的干扰；激光扫描共聚焦显微镜利用激光束经照明针孔形成点光源对标本内焦平面的每一点扫描，标本上的被照射点，在探测针孔处成像，由探测针孔后的光点倍增管（PMT）或冷电耦器件（cCCD）逐点或逐线接收，迅速在计算机监视器屏幕上形成荧光图像。照明针孔与探测针孔相对于物镜焦平面是共轭的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，这样得到的共聚焦图像是标本的光学横断面，克服了普通显微镜图像模糊的缺点。基本原理激光扫描共聚焦成像系统共聚焦显微镜的优点用激光作光源，逐点、逐行、逐面快速扫描。能显示细胞样品的立体结构。分辨力是普通光学显微镜的3倍。用途类似荧光显微镜，但能扫描不同层次，形成立体图像。FluorescentMicroscopeObjectiveArcLampEmissionFilterExcitationDiaphragmOcularExcitationFilterObjectiveLaserEmissionPinholeExcitationPinholePMTEmissionFilterExcitationFilterConfocalMicroscope3DImageReconstructionzxyzxyzyy3DImageReconstructionxyzyyz3DImageReconstruction.IsletofLangerhansTriplelabelledisletofLangerhansextractedfromPancreas.LabelledwithFITC-anti-isnsulin(green),CY3-ant-somatostatin(red)andCY5-anti-glucagon(blue)..MouseOocytes-calcium.DemonstratesnuclearCalciumfluctuationsinmouseoocytesattheonsetofmeioticresumption.NuCagreen(MolProbesInc)hasbeenusedastheCalciumprobe.t3colourprojectionof18opticalsectionsthroughalivingleaf.Visualisedbyauto-fluorescent.LCSMImageofaXenopusMelanophoremicrotubulecytoskeleton(green)andthenucleus(blue)（四）数字成像显微技术•摄像机随机摄取同一区域的多幅图象，信号通过计算机放大，多幅图相加并平均，使信号反差增强。•图象数字化处理技术提高信/噪比Anexampleoftheimagesproducedbytoday'simprovedmicroscopesispresentedinFigure1,whichillustratesadigitallycapturedmulticolorfluorescenceimageoftissueculturecellstakenonanEclipseE600microscopeusingtheCFI6040×fluoriteobjectiveandNikon'snewDXM1200digitalcamera.暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）的聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。（五）暗场显微技术DarkfieldMicroscopyDictydiumcancellatum•ThephotomicrographbelowillustratestheslimemoldfungusDictydiumcancellatumunderdarkfieldillumination,imagedwitha10×objectiveonaNikonOptiphotmicroscope.（六）、相差显微镜相差显微镜（phasecontrastmicroscope）由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：1.环形光阑（annulardiaphragm）位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。2.相位板（annularphaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。分为两种：√A+相板：将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。√B+相板：将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。图2-6相差显微镜照明原理图2-7一种介壳虫的染色体（PCM照片）（七）、微分干涉差显微镜1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜(differentialinterferencecontrast(DIC)microscope)，其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。DIC显微镜使细胞的细微结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。目前像基因注入、核移植、转基因动物等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。Fig.1-2:Afibroblastintissueculturevisualizedwithfourtypesoflightmicroscopy.Theimagein(A)wasobtainedbythesimpletransmissionoflightthroughthecell,atechniqueknownasbright-fieldmicroscopy.(B)Phase-contrastmicroscopy;(C)DICmicroscopy;and(D)dark-fieldmicroscopy.四种观察方式比较（七）录像增加反差显微技术•录像机+图象处理技术高度光敏感摄像机获取信号可以数字化后输入计算机计算机弥补光学系统的缺点而达到理论上的分辨率0.61λ分辨率D=N=1,Sin180/2=1N.Sin(/2)λ越小分辨率越高人们寻找更短波长的照明物质以提高分辨率光学显微镜的分辨率在理论上不能小于0.2nm,这是因为受光波波长的局限,即可见光的波长不能小400nm。电镜是利用电子束对样品放大成像的显微镜，电子束波长为0.01-0.9nm，因而分辨率大大提高。二、电子显微镜技术（一）电子显微镜的基本知识1.电子显微镜的分辨本领与有效放大倍数分辨本领：电镜在最佳状态下的分辨率可达0.2nm放大倍数：电镜比光镜观察到更加细微的结构，主要是因为电镜具有更高的分辨率而不是通常所说的放大倍数高。2.电镜与光镜的基本区别光镜电镜•光源可见光（300-700nm）电子束紫外光（200nm）•分辨率100-200nm0.1nm•透镜玻璃透镜磁透镜•真空无要求1.33×10-3—10-5PaTEM3.电镜的基本构造•电子照明系统电子枪（高频电流加热钨丝发出电子）聚光镜（静电透镜）—汇聚电子束•电磁透镜成像系统物镜、中间镜、放大镜•真空系统保持电子枪、镜筒和记录系统的高真空•记录系统荧光屏和感光胶片•电源系统供给高压、恒电电压和电流电镜的类型•透射电镜TEM（TransmissionElectronMicroscope）内部结构观察•扫描电镜SEM（ScanningElectronMicroscope）外部形态观察•扫描透射电镜STEM（ScanningTransmissionElectronMicroscope）外部形态及内部结构观察•超高压透射电镜（Ultra-voltageTransmissionElectronMicroscope）活体观察扫描电镜•结构和原理扫描电镜利用从块状样品表面收集到的信号电子成像,因