第二章 基因工程原理及其在食品工业中的应用

第二章基因工程原理及其在食品工业中的应用第一节基因工程基础（一）基因工程的定义1.基因（gene）DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质最小功能单位。2.基因组（geneome）一个生物体的全部基因序列。一、基因工程的定义、基本操作程序3.基因表达（geneexpression）遗传信息转录和翻译的过程。（1）转录。在DNA分子上合成出与其核苷酸顺序相对应的RNA的过程。（2）翻译。在RNA的控制下，根据核苷酸链上每三个核苷酸决定一个氨基酸的三联体密码规则，合成出具有特定氨基酸顺序的蛋白质肽链过程。（3）逆转录。以RNA为模板，按照RNA中的核苷酸顺序合成DNA的过程。4.重组DNA技术（recombinantDNAtechnique）利用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同的DNA进行体外切割、连接构成新的DNA分子的技术。5.基因工程（geneengineering）运用限制性内切核酸酶、连接酶等酶类将不同DNA进行体外切割、连接构成重组DNA，再将重组DNA经生物介导或直接导入等转移方法引入受体细胞进行克隆、表达，从而改变生物遗传性以创造生物新种质，或通过大量扩增为人类提供有用产品等的技术。6.食品基因工程利用基因工程的技术和手段，在分子水平上定向重组遗传物质，以改良食品的品质和性状，提高食品的营养价值、贮藏价格性状以及感官性状的技术。（二）基因工程的基本操作程序1.运用合适的方法从生物体中分离或通过化学合成制备目的基因。2.采用合适的方法将目的基因与合适的载体进行体外连接，构建重组DNA。3.利用合适的方法将重组DNA导入受体生物细胞以获得转化体。4.采用合适的方法筛选出重组转化体阳性克隆。5.运用合适的方法对重组转化体阳性克隆进一步分析以及操作，使目的基因在受体生物细胞中高效表达。（三）基因工程的三大理论和三大技术基础1.三大理论基础（1）1940年代Avery等人的肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA。（2）1950年代Watson和Crick发现了DNA分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理。（3）1960年代Crick关于遗传中心法则的确立，即生物体中遗传信息是按DNA→RNA→蛋白质方向进行传递。2.三大技术基础（1）如何从生物体庞大的双链DNA分子中将所需要的基因片段切割下来（限制性内切核酸酶）。（2）如何将获得的基因片段进行连接（DNA连接酶）。（3）如何将切割下来的基因片段进行繁殖扩增（基因载体）。二、基因工程的工具酶工具酶：基因工程的操作，是依赖于一些重要的酶（例如，限制酶、聚合酶、连接酶等）作为工具来对基因进行切割和拼接等操作，这些酶被称为工具酶。（一）限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶1.限制作用与修饰作用限制作用（restriction）：指一定类型的细菌可以通过其限制性内切核酸酶的作用，切割降解入侵的外源DNA，使得外源DNA的入侵受到限制的现象。修饰作用（modification）：指在DNA甲基化酶作用下，生物体自身DNA分子在特定碱基的特定位置上发生甲基化而得到修饰，从而免遭自身限制性内切核酸酶降解的现象。2.限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶限制性内切核酸酶（restrictionendonuclease）：简称限制酶，指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶。DNA甲基化酶（DNAmethylase）：简称甲基化酶，指一类能够识别DNA特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶。3.限制性内切核酸酶的类型（1）Ⅰ型。由三种不同亚基组成；辅助因子为ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸；切割位点距其识别位点至少1000bp；切割作用随机。Ⅰ型限制酶不宜作为基因工程的工具酶。（2）Ⅱ型。由两个相同亚基组成；辅助因子仅为Mg2+；识别位点常具旋转对称性；切割位点与其识别位点重叠或在其附近；切割作用特异性强。Ⅱ型限制酶是基因工程理想的工具酶。（3）Ⅲ型。由两种不同亚基组成；辅助因子为ATP和Mg2+，也受S-腺苷甲硫氨酸激活，但并非必需；切割位点一般在距其识别位点3’端24～26bp处。Ⅲ型限制酶在基因工程中也不常用。限制性内切核酸酶没有种属特异性，即限制性内切核酸酶识别、切割特定序列的能力同底物DNA的来源无关，它可识别、切割各种来源的DNA。DNA甲基化酶具有种属特异性，生物体的DNA甲基化酶只修饰保护自己的DNA，而不修饰保护非己的DNA。生物体的限制性内切核酸酶不能降解自身被修饰保护的DNA，而只能降解外源的DNA。表4-1限制性内切核酸酶的类型及主要特性主要特性Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型酶蛋白构成三种不同亚基两个相同亚基两种不同亚基酶活辅助因子ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸Mg2+ATP、Mg2+识别序列特性EcoBⅠ:TGAN8TGCTEcoKⅠ:AACN6GTGC旋转对称EcoPⅠ:AGACCEcoP15Ⅰ:CAGCAG切割位点距其特异识别位点至少1000bp处随机切割在特异切割位点上或其附近特异切割距其识别位点3’端24～26bp处特异切割4.Ⅱ型限制性内切核酸酶的切割方式在识别序列双链DNA两条链的对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成双链平齐末端。在识别序列双链DNA两条链的对称轴两侧同时从3’端切断磷酸二酯键，形成3’-羟基端2～5个核苷酸突出单链黏性末端。在识别序列双链DNA两条链的对称轴两侧同时从5’端切断磷酸二酯键，形成5’-磷酸端2～5个核苷酸突出单链黏性末端。5.影响限制性核酸内切酶活性的主要因素（1）底物DNA制备物的纯度蛋白质、十二烷基硫酸钠（SDS）、乙二胺四乙酸（EDTA）、酚、氯仿、乙醇及高浓度的盐离子等污染物都会抑制限制酶的活性。（2）底物DNA的甲基化程度dam甲基化酶：特异地催化DNA分子中5’GATC3’序列中的腺嘌呤N7位置的甲基化。dcm甲基化酶：催化DNA分子中5’CCAGG3’或5’CCTGG3’序列中的胞嘧啶C5位置的甲基化。（3）底物DNA的结构构型环状双螺旋DNA较线性DNA稳定。在用限制酶酶解同样分子质量的DNA时，环状双螺旋DNA所需酶量为线性DNA所需酶量的10～20倍。（4）酶反应缓冲液的组成酶反应体系中常含MgCl2、NaCl或KCl、三羟甲基氨基甲烷（Tris）-HCl、β-巯基乙醇、二硫苏糖醇（DTT）、牛血清白蛋白（BSA）等。Tris-HCl的作用在于使反应液的pH值稳定于酶活性所要求的最佳范围内，而后三者均有稳定酶的作用。（5）酶反应的最适温度大多数限制酶反应的最适温度为37℃，少数限制酶反应的最适温度高于或低于此温度。反应温度高于或低于其最适温度，酶的活力均会下降。应根据各限制酶反应的最适温度作相应调整。6.限制酶的主要用途（1）在特异位点上切割DNA，产生特异的限制酶切割的DNA片段。（2）建立DNA分子的限制酶图谱。限制酶图谱（restrictionmap）:指一系列限制酶的特异识别序列在DNA链上的出现频率和它们之间的相对位置。（3）构建基因文库。基因工程中，将某种生物的全部基因组的遗传信息，贮存在可以长期保存的稳定的重组体中，以备需要时能够随时应用它分离所需要的目的基因，这种保存基因组遗传信息的材料，称为基因文库（genelibrary）（4）用限制酶切出相同的黏性末端，以便重组DNA。（二）DNA聚合酶依赖于DNA的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）；大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）、耐热的DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶）等。依赖于RNA的DNA聚合酶（即逆转录酶）优先以RNA为模板，也可以DNA为模板。逆转录酶能以RNA为模板催化合成双链DNA。末端脱氧核苷酸转移酶（简称末端转移酶）不以DNA或RNA为模板，而只是将核苷酸加到已有DNA分子的末端。DNA聚合酶作用的条件（1）要有底物4种脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）为前体催化合成DNA，接受模板指导，产物的性质与模板编码相同。（2）不能起始合成新的DNA链，要有引物3’-羟基的存在。（3）催化dNTP加到生长中的DNA链的3’-羟基末端。（4）催化DNA合成的方向是5’→3’。1.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ（全酶）一种从大肠杆菌中分离出的一条分子质量为109KDa的多肽链（球蛋白）。具有三种活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物；②5’→3’外切核酸酶活性，从5’端既降解双链DNA，也降解RNA-DNA杂交体中的RNA链（RNA酶H活性）；③3’→5’外切核酸酶活性，底物为带3’自由羟基的双链DNA或单链DNA。主要用于：①以切刻平移法标记DNA；②对DNA分子的3’突出尾进行末端标记。2.大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片段（Klenow片段）一条分子质量为76KDa的多肽链，一般由大肠杆菌DNA聚合酶I全酶经枯草杆菌蛋白酶水解获得，也可通过克隆技术获得。具有两种活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物。②3’→5’外切核酸酶活性，底物为带3’自由羟基的双链DNA或单链DNA。3.TaqDNA聚合酶最初来源于水生栖热菌（Thermusaquaticus），现可由基因工程途径来生产。分子质量为65KDa，是一种非常耐热的依赖于DNA的DNA聚合酶。具有一种活性：5’→3’DNA聚合酶活性，以单链DNA为模板，以带3’自由羟基的DNA片段为引物。主要用于：①对DNA进行测序。②通过聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）对DNA分子的特定序列进行体外扩增。4.逆转录酶（依赖于RNA的DNA聚合酶）常用的逆转录酶有两种：一种来自禽成髓细胞瘤病毒（AMV），由两条多肽链组成，分子质量为170KDa。一种来自鼠白血病病毒（MLV）逆转录酶基因的大肠杆菌，由单链多肽组成，分子质量为84KDa。具有两种活性：①5’→3’DNA聚合酶活性，以RNA或者DNA为模板，以带3’自由羟基的RNA或DNA片段为引物。②RNA酶H活性，即5’→3’外切核糖核酸酶活性，特异地降解RNA-DNA杂交体中的RNA。逆转录酶无3’→5’外切核酸酶活性，即无校对功能，其催化的聚合反应容易出错。5.末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶）来源于小牛胸腺，分子质量为60KDa，是一种不需要模板的特殊的DNA聚合酶。具有一种活性：即末端转移酶活性，在二价阳离子存在下，其催化dNTP加于DNA分子的3’-羟基端。主要用于：①给载体DNA或cDNA加上互补的同聚尾。②以32P标记的一种dNTP或一种rNTP来标记DNA片段的3’端。（三）连接酶、磷酸酶1.T4噬菌体DNA连接酶来源于T4噬菌体感染的大肠杆菌，分子质量为68KDa。具有一种活性：即催化DNA的5’磷酸基与3’羟基之间形成磷酸二酯键。该酶的核酸底物为黏性末端DNA、平齐末端DNA等。主要用于：①连接带匹配黏性末端的DNA分子。②使平齐末端的双链DNA分子互相连接或与合成接头相连接。2.碱性磷酸酶来源于大肠杆菌及牛小肠。包括细菌碱性磷酸酶（bacterialalkalinephosphatase，BAP）和牛小肠碱性磷酸酶（calfintestinalalkalinephosphatase，CIP）。具磷酸酶活性，催化去除5’磷酸的反应。底物为单链或双链DNA及RNA、dNTP。主要用于：①在用32P标记5’末端前，去除DNA或RNA分子的5’磷酸。②去除DNA片段5’磷酸，以防自身环化。三、基因工程的载体载体（vector）：携带外源基因进入受体细胞的运载工具。基因工程载体的特性:（1）能在宿主细胞内进行独立和稳定的DNA自我复制。在插入外源基因后，仍然保持着稳定的复制状态和遗传特性。（2）易于从宿主细胞中分离，并进行纯化。（3）DNA序列中有适当的限制性内切酶位点，最好是单一酶切位点，并位于DNA复制的非必需区内，可以在这些位点上插入外源DNA，但不影响载体自身DNA的复制。（4）具有能够观察到的表型特征，在插入外源DNA后，