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第四章自然选育和诱变育种菌种选育经验育种定向育种自然选育诱变育种杂交育种分子育种主要通过突变和筛选来育种常规的杂交育种原生质体融合通过DNA重组技术来育种•第一节自然选育•自然选育：不经人工处理，利用微生物的自然突变进行菌种选育的过程•一、引起自然选育的因素•1、低剂量的诱变效应•2、互变异构效应基因突变二、微生物突变的类型1、形态突变型2、致死突变型3、抗性突变型4、营养缺陷型突变型青霉三、微生物突变的特点1、不对应性2、自发性3、稀有性4、独立性5、诱变性6、稳定性7、可逆性稀释法•（四）、自然选育的程序•1.采样•2.增殖培养•3.纯种分离•4.生产性能的测定划线法•第二节、诱变育种•一概念：•诱变育种是利用各种诱变剂处理微生物细胞，提高基因突变频率，再通过适当的筛选方法获得高产优质菌种的育种方法。二诱变育种的原理•基因突变:染色体畸变和点突变。染色体畸变：指的是染色体或DNA片段发生缺失、易位、逆位、重复等。点突变：指的是DNA中的碱基发生变化。三、常用的诱变剂种类1、物理诱变剂：紫外线、快中子2、化学诱变剂：5—BU（5-溴尿嘧啶）硫酸二乙酯，亚硝基胍3、生物诱变剂：噬菌体3、使用方法：单一诱变剂处理:复合诱变剂处理：野生型菌株突变菌株原养型菌株诱变二次诱变或回复突变诱变育种中还常常采取诱变剂复合处理，使它们产生协同效应。•四、常用诱变剂的具体使用方法：•1、紫外线：•A、诱变处理前，先开紫外灯预热20分钟，使光波稳定。•B、将3—5ml细胞悬浮液置于培养皿,于诱变箱内的电磁搅拌器上，照射3—5分钟，进行表面杀菌。•C、打开培养皿盖，开启电磁搅拌器，边照射边搅拌。•D、处理一定时间后，在红外灯下，吸取一定量菌液，经稀释后，取0.2毫升涂平板。•2.5-溴尿嘧啶：•A、称取5-溴尿嘧啶，加入无菌生理盐水微热溶解，使浓度为2mg/ml。•B、将细胞培养至对数期并重悬于缓冲液或生理盐水中过夜。•C、将5-溴尿嘧啶加入培养基内，一般为10—20微克/ml，倒平板。•D、涂布菌液，在生长中诱变，挑单菌落进行测定。五、诱变育种的一般程序出发菌株菌种纯化同步培养制备单孢子悬浮液诱变剂处理平板分离挑选疑似突变菌落纯培养突变体的初步筛选重复筛选选出突变体1、同步培养诱变处理前，菌悬液的细胞应尽可能达到同步生长状态，培养出生理活性一致的细胞。同步生长细胞的培养就及其收集2.孢子或菌体悬浮液的制备用生理盐水或缓冲溶液配制，先用无菌的玻璃珠振荡分开，再用脱脂棉过滤。•3·变异菌株的初步筛选•1）利用形态突变直接淘汰低产变异菌株。•2）利用平皿反应直接挑取高产变异菌株。饱浸含某种指示剂的固体培养基的滤纸片变色圈指示剂直接掺入或喷洒固体培养基，菌落周围形成变色圈。如淀粉的平皿上喷上稀碘液固体培养基中渗入溶解性差、可被特定菌利用的营养成分，造成不透明的培养基背景。菌落利用此物质形成透明圈。利用一些有特别营养要求的微生物作为工具菌，如待筛选菌具有该营养物的前体转化成营养物能力，工具菌就能围绕该菌生长待筛选的菌株能分泌产生某些能抑制工具菌生长的物质第三节营养缺陷型突变体的筛选及应用一、营养缺陷型：指通过诱变而产生的丧失了合成某种营养物质的能力，必须在基本培养基中加入相应缺陷的物质才能正常生长的变异菌株。•二、筛选营养缺陷型的培养基：•基本培养基[-]:凡是能满足某种野生菌株营养要求最低成分的合成培养基。•完全培养基:凡能满足一切营养缺陷株营养需要的培养基[+]。•补充培养基[A]：只能满足相应的营养缺陷型生长需要的组合培养基。三、营养缺陷型菌株筛选的一般方法1.诱变处理2.淘汰野生型•A、抗菌素法:将抗生素加入到基本培养基中，杀死生长野生型菌株，浓缩营养缺陷型。用加有青霉素的基本培养基分离培养诱变处理后的菌体，野生型菌株因为繁殖产生的子细胞不能合成正常细胞壁而死亡，而对不能繁殖的营养缺陷型细胞因为在基本培养基中不能繁殖而得以保留。酵母菌：用加有制霉菌素基本培养基分离培养诱变处理后的菌体，制霉菌素抑制真菌细胞壁中甾醇合成，从而使繁殖中的细胞产生的子细胞死亡，保留营养缺陷型细胞。B、菌丝过滤法:诱变后的孢子在[—]中培养一段时间后过滤，去除大部分野生型菌株，浓缩营养缺陷型。Sartorius正压式过滤器真菌和放线菌等丝状菌的野生型菌株在基本培养基中产生菌丝体，而营养缺陷型菌株以孢子形式存在，不能萌发。把诱变处理后的孢子悬液用液体基本培养基培养，适温振荡培养，使野生型孢子萌发形成菌丝体，用灭菌脱脂棉、滤纸等除去菌丝体，再培养，再过滤。重复3～4次，最大限度地除去野生型菌株，然后再分离•三、检出所需缺陷型逐个检出法经诱变处理后的细胞涂布在平板上，待长出单个菌落后，用接种针将这些单个菌落逐个依次地分别接种到基本培养基和另一完全培养基。经培养后，如果在完全培养基上的某一部位上出现菌落，而在基本培养基上却不长菌，说明这是一个营养缺陷型。•三、检出所需缺陷型影印培养法将长出菌落的平皿开口朝下，在丝绒布上轻轻地印一下，把此皿上的全部菌落转印到另一基本培养基平板上。经培养后，比较这两个平皿上长出的菌落，如果发现前一平皿上某一部位长有菌落，而在后一培养基的相应部位上却没有，说明这就是一个营养缺陷型。一般从菌落大小也可以判断，新长出的菌落较小，即是营养缺陷型夹层培养法A、夹层培养法:先在培养皿中倒一薄层不含菌的基本培养基，待冷凝后加上一层含诱变处理菌液的基本培养基，其上再浇一薄层不含菌的基本培养基。经培养后在培养皿底用笔对首次出现的菌落作记号，然后再在其上倒一薄层完全培养基。再经培养后所出现的新菌落，多数为营养缺陷型。•四.鉴定营养缺陷型生长谱法方法一：把纯化好的缺陷型菌株与基本培养基倒混合平板或涂布平板，再在平板上点接各种营养物质（最好稀释成一定浓度，用滤纸片法接入），适温培养，观察生长圈。此法可以在一个平板上对一株菌进行多种营养因子进行测定方法二：在基本培养基中加入某种营养物质，倒混合平板，再点接菌株，观察生长圈。此法可同时对多个菌株进行测定五、营养缺陷型突变株的应用•1.工业微生物育种中，用于积累代谢中间产物•2.作为杂交、重组育种的遗传标记•3.用于微生物代谢途径研究•4.在转化、转导、原生质体融合、质粒和转座子研究中用作标记菌株营养缺陷型的应用实例利用营养缺陷型突变株来生产氨基酸和核苷酸是典型的例子天冬氨酸激酶(AK)被赖氨酸及苏氨酸协同反馈所抑制通过诱变处理，获得高丝氨酸缺陷型突变菌株，该突变型不能产生苏氨酸。在限量高丝氨酸的培养基中缺陷型菌株能够正常生长，并且因为消除了反馈抑制突变型能过量生产L-赖氨酸第四节温度敏感突变株的筛选一、温度敏感突变株（temperature-sensitivemutant,TS突变体）：突变株在一定温度范围内（许可温度）正常生长，其表型和野生型没有区别，但超出这一温度范围（非许可温度），则不能生长或生长微弱甚至死亡（条件致死）或某些代谢停止或减弱。二、TS突变的原理•TS突变主要是由必需基因发生突变，致使该基因在一定温度条件下无法正常表达，或其编码的酶失活，造成细胞不能正常生长。三、TS突变株的选育方法（一）TS突变株的诱发TS突变主要由基因错义突变所致，要选择易于引起碱基置换的亚硝基类、磺酸酯类化合物，或亚硝酸、UV等诱变剂。（二）淘汰野生型菌株/TS菌株富集培养抗生素法：加入抗生素，在非许可温度下培养一定时间，杀灭在该温度下生长的野生型菌株，再离心除去抗生素，分离四、TS突变株分离筛选•富集培养后，用完全培养基先在许可温度下培养，再用影印法、点植法等方法在许可温度和非许可温度下分别培养，对照结果即可检出TS突变体；•也可同一平板先在非许可温度培养，长出野生型菌株，做好记号，再转许可温度培养，则后长出的为TS菌株。五、TS突变株在发酵工业中应用1、在谷氨酸发酵中的应用增加谷氨酸产量的关键在于改变菌体的细胞膜结构和功能，通过一些有效方法使谷氨酸产生菌由谷氨酸非积累型转变为积累型。如：以乳糖发酵杆菌NO2256为出发菌株，选育出细胞膜结构或功能缺损的TS突变株88号，通过温度来调节细胞膜透性。当在许可温度(30℃)下培养繁殖得到一定量菌体后，升温致非许可温度(37℃)培养，使细胞膜的合成、结构或功能发生障碍，结果突变株能在高浓度生物素培养基中分泌大量谷氨酸。2、TS突变株在丝氨酸发酵中的应用以C1化合物为唯一碳源的微生物合成细胞组分是通过丝氨酸途径来实现的。要提高丝氨酸产量，关键在于阻断丝氨酸降解。日本味之素公司的Moringga筛选到TS突变株，它们在30℃丝氨酸降解正常，但在38～40℃失去降解丝氨酸的能力，因而大量分泌丝氨酸第五节诱变育种实例一、产环己酰亚胺新菌株YIM41004的复合诱变选育前言：环己酰亚胺（cycloheximide）,又名放线酮（Actidione），是于1948年德国化学家B.E.Leach等分离并鉴定出来的一种戊二酰类化合物.它对多种真菌具有拮抗作用，其制剂具有水溶解性良好、作用剂量低的优点,在植物保护方面得到广泛应用。云南大学省微生物研究所教育部微生物资源重点实验室）发现一株产生具有产生环己酰亚胺类化合物的放线菌新种Streptomycesyunnanensis,典型菌株为YIM41004（一）产环己酰亚胺新菌株YIM41004的复合诱变选育为了选育出活性物质产量高、遗传性状稳定、培养要求低、工艺简单的优良菌株,作者采用紫外线（UV）、亚硝基胍（NTG）、UV+LiCl和60Co对YIM41004进行了复合诱变研究。经过八代诱变育种，到一株生产特性和生长特性均有所改善的变异菌株F8-439.（二）孢子悬液预培养用种子培养基刮洗下5~7d成熟斜面孢子，并稀释到1千万至1亿个孢子每毫升，置于50mL带玻璃珠和搅拌子的三角瓶中，28℃磁力搅拌培养到大多数孢子开始萌发（约3~4h).60Co诱变时不做预培养.（三）诱变处理方法1UV诱变一切操作在红光下或避光进行.取经预培养的孢子悬液8mL于直径9cm带搅拌子平皿中，在诱变箱中(提前开紫外灯0.5h)磁力搅拌，15W30cm照射一定时间.收集于试管中，冰水浴2h，钝化修复酶.涂布基础培养基分离平板，28℃避光培养2~3d.2、亚硝基胍（NTG）诱变于通风橱中准确称量NTG，加助溶剂甲酰胺或丙酮少许（1~2mL）,用pH6.0磷酸缓冲液溶解成1mg·mL-1，保存于棕色瓶中.NTG不用灭菌，现配现用.采用混合平板涂菌法：先倒好含5~25μg·mL-1NAG的混合平板,再用预培养好的孢子悬液涂布分离平板，28℃避光培养3~4d.360Co诱变每支试管中装3mL用生理盐水稀释到106~107孢子/mL的孢子悬液，整个过程置于装有冰水的烧杯中，照射剂量以处理总剂量计算.4UV+LiCl复合诱变孢子悬液按UV诱变常规处理后涂布于含0.1~1.0%LiCl(W/V)的分离平板上，28℃培养3~4d.（三）筛选步骤1－预筛1琼脂块法预筛琼脂块制备:在直径9cm平皿中定量加入30mL基础培养基,冷却凝固后用直径6mm打孔器打好琼脂块，然后用竹签把琼脂块移至直径9cm空平皿中单菌落点接琼脂块和培养:挑取Ⅰ型菌落，或形态变异明显的菌落，点接到琼脂块上.每次诱变最少挑200株.把以上平皿置于保湿盒内，28℃培养2d，使活性物质积累于琼脂块中;琼脂块生测:把培养好的琼脂块移到生测平板上，28℃培养2d,测量抑菌圈直径.每生测平板挑取抑菌圈最大的菌落2~3个，接种斜面,每次诱变最少挑50株.（三）筛选步骤2小瓶发酵初筛预筛所得菌株斜面培养5~7d，待孢子成熟，刮取约1/4斜面孢子，接种于装有20mL发酵培养基的250mL三角瓶中，200r/min，28℃培养96h.发酵液4000r/min离心10min，取40μL上清液用杯碟法生测初筛出抑菌圈最大的20株用于复筛和菌种保藏.（三）筛选步骤3－复筛3大瓶复发酵复筛用初筛出的5~8株菌成熟斜面孢子接种于装有100mL种子培养基的500mL三角瓶，200r/min，28℃培养48h，得种子液.取种子液10mL接种于装有8