RealtimePCRMasterMix(SYBRG

08-01RealtimePCRMasterMix(SYBRGreen)CodeNo.QPK-201,201T研究用使用说明书TOYOBOCO.,LTD.BiochemicalOperationsDepartmentOSAKAJANPANDistributor:ShanghaiSOLOMONbio-sci&tech,Co.Ltd.Tel:[phone]Email:[e-mail]——目录——[1]前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1[2]注意事项⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯1[3]产品内容⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2[4]需备物品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2[5]操作步骤⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯3[6]常见问题⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯6[7]相关产品⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯7“PurchaseofthisproductisaccompaniedbyalimitedlicensetouseitinthePolymeraseChainReaction(PCR)processforTheResearchFieldinconjunctionwithathermalcyclerwhoseuseintheautomatedperformanceofthePCRprocessiscoveredbytheup-frontlicensefee,eitherbypaymenttoAppliedBiosystemsoraspurchased,i.e.,anauthorizedthermalcycler.”※LightCyclerTM是IdahoTechnologyInc.的注册商标。※TaqMan®是RocheMolecularSystemsInc.的注册商标。※ABIPRISM®是AppliedBiosystemsInc.的注册商标。本试剂盒内包含的试剂全部为研究用，请勿将其作为诊断及临床试剂使用。使用本试剂盒时，请严格遵守实验室内的常规注意事项及安全。Tel:[phone]Email:[e-mail]:www.solomonbio.com0[1]前言1．本产品概要本产品已包括除引物和样品DNA以外的所有组成部分，为2×mastermix。已含有SYBR®GreenI(MolecularProbesInc.)，可用于以未标记引物进行的掺入法Realtime定量PCR。2．本产品特征·高适用性1）本产品中添加了BSA，能够应用于RocheDiagnostic公司的LightCyclerTM以及其它使用GlassCapillary的分析体系。2）本产品中还添加了Passivereference，可应用于AppliedBiosystems公司的ABIPRISM®7700等定量PCR仪。经确认，Passivereference不会对LightCyclerTM等产生影响。3）也可应用于BioFlux的LineGene定量PCR仪。·可进行高速热启动为了抑制非特异性反应，本产品加入了抗TaqDNA多聚酶的单克隆抗体进行热启动。此方法的特征是酶活力的释放极快，变性条件下，在1分钟内即可完成；各循环的变性步骤与普通PCR相同。如果使用LightCyclerTM等高速PCR仪，则更能显示出其缩短时间的优越性。[2]注意事项1．关于使用·本产品为研究用试剂。请勿作为诊断、临床试剂用。另外，对于本产品的有害性调查还不十分完整。请适当使用保护用品，安全操作。·一经融解后，请缓慢颠倒，充分混刀。2．关于保存本产品原则上在-20℃以下遮光冷冻保存。但是，如果在短期内需持续使用时，可于融解后在4℃遮光保存，此时最长可保存3周。保存时请使用遮光箱或产品内配有的铝袋(QPK-201中，除包装以外，另附一个铝袋，可将融解后产品装入此袋，4℃保存)。建议每支产品融解后，于4℃状态保存并于3周内使用完毕。融解后的产品短期内不用时，请装入原包装袋，再次于-20℃状态下进行遮光冷冻保存。Tel:[phone]Email:[e-mail]:www.solomonbio.com1[3]产品内容[SYBR®GreenRealtimePCRMasterMix]已经包含除引物以外所有的PCR反应所需的试剂，如dNTPs、MgCl2、TaqDNA多聚酶、抗Taq单克隆抗体等，并且已经包含了SYBR®GreenI，本品为2倍浓度的溶液。[4]需备试剂1．必需的试剂、仪器[引物]请事先准备用于检出·定量对象基因序列的引物对。如果需要重复进行定量试验时，建议在对PCR循环条件或引物浓度进行调整的基础上，选择最适当的引物和反应条件。※关于引物的设计在引物设计过程中尽可能避免引物二聚体等现象的发生。掺入Assay中，也会检测出引物二聚体等非特异性扩增产物，在扩增曲线上无法区别。引物的设计对灵敏度很重要。目标片段的长度也很重要。一般来说，目标片段越长越容易产生非特异性反应，扩增效率也较低，所以目标片段最好控制在200bp以下，建议尽可能在150bp以下。[蒸馏水]：请使用PCR用纯水。[RealtimePCR仪]请使用AppliedBiosystems公司的ABIPRISM®7700、RocheDiagnostic公司的LightCyclerTM、BioFlux公司的LineGene等的RealtimePCR仪。使用方法请根据相应仪器的说明书。２．样品DNA[cDNA]·1ststrandcDNA合成产物请使用苯酚处理·乙醇沉淀等方法提纯。1ststrandcDNA合成时的引物，可采用随机引物或者Oligo（dT）引物，请注意引物用量对于后续PCR反应的影响。·如果使用本公司的1ststrandcDNA合成试剂盒「ReverTraAce-α-®」(Code:FSK-100或FSQ)，请稀释10倍以上使用。原液也可以进行扩增，但会对cDNA合成时的引物或逆转录酶对PCR的定量会产生影响，因此，建议稀释后使用。Tel:[phone]Email:[e-mail]:www.solomonbio.com2［５］操作步骤１．50ul反应体系分析方法：（以ABIPRISM®7700为例）(1)反应液的配制[PCR反应液(例)](引物终浓度0.2μM、反应总体积50μl)·将SYBR®GreenRealtimePCRMasterMix设定为总反应体积的1/2，其它的组成部分请按照最适当条件变更。另外，如果要变更反应总体积时，请保持最适条件下各组分的比例。·引物浓度请在0.2～0.6μM的范围内进行调整。扩增效率不高时，可适当增加引物的用量，但是引物太多，可能会导致非特异性增加。(2)PCR的循环条件·下面是PCR实例。复性／延伸温度，请结合引物的Tm值在55℃～65℃左右进行调整。当然引物结合的最佳值可能超出此范围，此时请根据实际情况进行设定。·本产品可以在极短时间内释放多聚酶的活性，因此，最初的变性时间可以设定为60秒，循环中变性时间可以设定为15秒。·可将Detector设为「SYBR」、Quencher设为「None」。详细的设定请参照定量PCR仪的说明书。·也可以进行3步法PCR（例2）。与2步法相比，发生非特异性的可能性要小一点，请根据发生状况进行尝试。此时，请结合引物调整退火温度。退火温度较低的引物建议使用3步法。·RealtimePCR一般不进行长片段扩增，所以不需要对延伸时间进行调整。如果要调整，也务必确保datacollection步骤至少30秒以上。Tel:[phone]Email:[e-mail]:www.solomonbio.com3·详细的设定请参照定量PCR仪的说明书。[PCR循环(例1)](2步法、复性／延伸温度60℃)2．20ul反应体系分析方法：（以用RocheLightCyclerTM为例）(1)反应液的配制PCR反应液(例)](引物0.2μM、总体积20μl)·将SYBR®GreenRealtimePCRMasterMix设定为总体积的1/2，其它的组分请按照最适条件调整。另外，改变反应总体积时，请Tel:[phone]Email:[e-mail]:www.solomonbio.com4保持最适当条件下各组分的比例。·引物浓度请在0.2～0.6μM的范围内进行调整。扩增效率不高时，可适当增加引物的用量，但引物太多，可能会导致非特异性增加。(2)PCR的实施·下面是PCR实例。复性／延伸温度，请结合引物的Tm值在55℃～65℃左右进行调整。当然引物结合的最佳值可能超出此范围，此时请根据实际情况进行设定。通常将结合时间设定为0秒（一旦达到温度立即升温），请根据情况进行设定。·本产品可以在极短时间释放多聚酶的活性，因此，最初变性时间可以设定为30秒，各循环中的变性时间可以设定为0秒（一旦达到变性温度马上降温）。但是，对于GC含量高的目标片段，有时将各循环的变性时间设定为5秒较好。·目标片段在200bp以内的反应，通常将延伸时间设定为15秒，可根据实际情况进行调整。但是请保证数据收集步骤在10秒以上。·Detector可用F1，另外，通常TemperatureTransitionRate全部设为20℃/sec(最大)。详细设定请参考相应定量PCR仪的说明书。·也可尝试采用2步法，此时，请在复性·延伸步骤进行数据收集。[PCR循环(例)](3步法退火55℃15秒／延伸72℃)Tel:[phone]Email:[e-mail]:www.solomonbio.com5［６］常见问题１．扩增曲线混乱(1)PCR仪设定方面的问题(参照相应仪器的说明书)(2)试剂方面的问题２．定量值重现性差(1)仪器设定方面的问题(参照相关仪器的说明书)(2)试剂方面的问题３．空白样品中有信号请在熔解曲线分析的基础上进行判断。Tel:[phone]Email:[e-mail]:www.solomonbio.com6(1)融解曲线顶点所对应的温度与阳性样品相同(2)熔解曲线顶点所对应的温度比阳性样品低[7]相关产品NPK-200总RNA抽提试剂盒-MagExtractor-RNA-50TSTRI-101总RNA抽提试剂-TRIzolReagent100mlFSK-100cDNA合成试剂盒-ReverTraAce-α50TFSQ-101cDNA合成试剂盒(QPCR用)-QPCRRTKit200TTRT-101逆转录酶的领袖-ReverTraAce10000USIN-101RNA酶抑制剂-RnaseInhibitor2000UFSK-201Oligo(dT)引物-Oligo(dT)201nmFSK-301随机引物-RandomPrimer(9mer)2.5nmQPK-201RealtimePCRMasterMix(SYBRGreen)200TQPK-212SYBRGreenRealtimePCRMasterMix-PLUS200TQPK-101RealtimePCRMasterMix(ForTaqman)200TQRT-101OneStepqRT-PCRMasterMix(Taqman)100TQRT-201OneStepqRT-PCRMasterMix(SYBRGreen)100TTel:[phone]Email:[e-mail]:www.solomonbio.com7[Manufacturer]TOYOBOCO.,LTD.Biochemi