第08章 酶免疫技术

免疫标记技术酶免疫技术生物素－亲合素放大技术放射免疫技术荧光免疫技术化学发光免疫技术固相膜免疫测定和金标记技术免疫组织化学技术三大标记技术第八章酶免疫技术酶联试剂阳性对照酶标记物显色液A终止液反应板显色液B浓缩洗涤液加样枪与吸头阴性对照第1节概述第2节均相酶免疫测定第3节异相酶免疫测定第4节酶免疫测定技术的特点和应用1.酶免疫技术的原理用酶标记抗原或抗体，并参与抗原和抗体反应，酶催化底物可产生易于检测并被放大的信号,通过仪器检测信号来实现高敏感度检测抗原-抗体反应的目的。基本步骤：Ag+Ab+酶—Ag/Ab+底物→显色反应体系酶标记物显色体系特点：定位、定量、定性检测生物放大作用，灵敏度高一、基本原理标记酶的要求：活性高性质稳定专一性强酶催化底物的显色信号易于判断和测量方法敏感，重复性好，简单易行酶的底物易于配制保存，酶及底物价廉２.常用的酶及其底物（1）辣根过氧化物酶（HRP）来源：辣根组成：主酶——糖蛋白（无色）辅基——亚铁血红素（棕色）特点：应用广泛，易于提取，价格便宜性质稳定，标记后活性无影响作用：属过氧化氢酶，在过氧化氢存在时，能催化苯酚或苯胺及其取代物聚合２.常用的酶及其底物（1）辣根过氧化物酶（HRP）参与催化反应：DH2+H2O2→D+2H2O供氢体受氢体脱氢聚合受氢常用底物：邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB）5-氨基水杨酸（5-ASA）２.常用的酶及其底物常用底物：①邻苯二胺（OPD）结构：特点：HRP最敏感的色原底物之一反应橙黄色，终止液作用后棕黄色最大吸收波长492nm缺点：稳定性差，易变色，应避光致癌作用２.常用的酶及其底物常用底物：②四甲基联苯胺（TMB）结构：特点：优于OPD反应蓝色，终止液作用后黄色最大吸收波长450nm优点：稳定性好无需避光无致癌作用２.常用的酶及其底物常用底物：③5-氨基水杨酸（5-ASA）结构：特点：反应后呈棕色２.常用的酶及其底物（2）碱性磷酸酶（AP）来源：大肠杆菌或小牛肠黏膜组成：菌源性AP肠黏膜AP——活性较高特点：敏感性高于HRP系统获得困难，价格高纯度低，稳定性低标记时成功率低注意：AP可被磷酸盐缓冲液抑制（PBS）２.常用的酶及其底物（2）碱性磷酸酶（AP）作用：属磷酸酯水解酶催化核酸分子脱5，磷酸基团催化蛋白去磷酸化，形成-OH常用底物：对-硝基苯磷酸脂（p-NPP）结构：特点：反应后形成黄色对硝基酚最大吸收波长405nm标记时成功率低２.常用的酶及其底物２.常用的酶及其底物（3）β-半乳糖苷酶（β-Gal）来源：大肠埃希菌特点：人血中缺乏，不受样品内源酶干扰作用：属半乳糖苷酶水解含半乳糖苷键的物质可将乳糖水解成葡糖糖和半乳糖２.常用的酶及其底物（3）β-半乳糖苷酶（β-Gal）常用底物：4-甲基伞酮基-β-D半乳糖苷(4MUG)结构：特点：催化后形成4-甲基伞形酮(4MU)为高强荧光物优点：敏感度高，较HRP高30~50倍３.酶标记抗体或抗原的方法（1）交联法以双功能交联剂为“桥”，分别与酶和抗体（抗原）连接形成结合物。戊二醛交联法：两个醛基分别结合酶蛋白和抗体蛋白的胺基，将两者相联。戊二醛３.酶标记抗体或抗原的方法（2）直接法用过碘酸钠使酶蛋白分子中多糖的羟基生成醛基，醛基再与抗体（抗原）结合。改良过碘酸钠法：氧化+还原羟基醛基氨基亚胺4.固相载体酶免疫技术中将游离和结合酶标记物迅速分离的最常用方法。要求：与Ag或Ab结合牢固容量大经反复洗涤不易脱落对固定其上的Ag或Ab活性无影响种类：聚苯乙烯（塑料）微粒（高分子单体聚合物）膜载体（硝酸纤维素膜）4.固相载体包被：将抗原或抗体结合于固相载体的过程。封闭：抗原或抗体包被后，为防止固相载体没有完全包被，可能在后续实验中非特异性吸附蛋白，因此用1%~5%的牛血清白蛋白或5%~20%小牛血清重新包被，覆盖所有蛋白结合位点，消除非特异性吸附。酶免疫测定固相酶免疫测定异相酶免疫测定异相液相酶免疫测定酶免疫技术酶免疫组化均相酶免疫测定（ELISA）二、技术类型第2节异相酶免疫测定异相酶免疫测定:酶标抗体结合抗原形成复合物后，分离复合物中结合酶标物与游离酶标物，再加入底物显色,以测定体系中待测抗原或抗体的量。根据有无固相的支持物分为：异相液相酶免疫测定（液体离心分离）固相酶免疫测定（固相固定分离）ELISA（1971年创立）一、酶联免疫吸附试验(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)基本原理使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性（包被抗原或抗体）在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应（抗原抗体反应）用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。（游离与结合标记物的分离）加入底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。（显色反应）ELISA的反应系统固相的支持物固相的抗原或抗体酶标记的抗原或抗体酶作用的底物待测标本ELISA检测仪二、应用ELISA检测抗原的技术类型双抗体夹心法双位点一步法竞争法(三明治法)1.双抗体夹心法(两步法)包被抗体→洗涤→加待测抗原→洗涤→加酶标记抗体→洗涤→加底物→显色→直接观察或酶标仪测定双抗体夹心法的特点与应用条件非竞争结合反应常用于抗原的检测适用于分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原，而不能用于小分子半抗原的检测所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的相同或不同抗原决定簇2.双位点一步法所用两种抗体分别针对同一个抗原分子的不同抗原决定簇两种抗体同时与抗原反应时互不干扰方法：包被抗体→洗涤→加待测抗原和酶标记抗体→洗涤→加底物→显色→直接观察或酶标仪测定3.竞争法竞争法的特点：用于抗原和半抗原的定量测定，也可对抗体进行测定。酶标Ag（Ab）与样品或标准品中的非标记Ag（Ab）具有相同的与固相Ab(Ag)结合的能力。反应体系中，固相Ab（Ag）和酶标Ag（Ab）是固定限量的，且前者的结合位点少于酶标记与非标记Ag（Ab）的分子数量和。反应后，结合与固相载体上复合物中被测定的酶标Ag（Ab）的量（酶活性）与样品中非标记Ag（Ab）的浓度成反比。三、应用ELISA检测抗体的技术类型双抗原夹心法竞争法间接法捕获法1.间接法包被抗原→洗涤→加待测抗体→洗涤→加酶标记抗体（二抗）→洗涤→加底物→显色→直接观察或酶标仪测定间接法的特点二抗通常为羊抗人IgG，因此可检测人血清中IgG类抗体检测其他抗体时，只需改变相应包被抗原，二抗可以通用，节省试剂2.捕获法（反向间接法）•主要用于血清中某种抗体亚型成分（如IgM）的测定。①②③捕获法的特点适用于人血清中IgM类抗体的检测以羊抗人IgMμ链抗体包被，可结合IgM类抗体，排除了血清中大量IgG类抗体的干扰捕获法是指对血清中IgM类抗体的捕获2.捕获法（反向间接法）特点与双抗体夹心法相似，分两步和一步法优点：灵敏度和特异性均高于间接法缺点：试剂消耗大，需要各种不同的包被抗原和酶标抗原3.双抗原夹心法4.竞争法方法抗原包被→待测抗体与酶标抗体竞争抗体包被→待测抗体与包被抗体竞争抗原第3节均相酶免疫测定基本原理利用酶标抗体结合抗原形成复合物后，标记的酶活性发生改变，无需分离复合物与游离酶标抗体，直接测定系统中酶活性的改变，进而推算出待检样品中的抗原量。主要用于检测小分子抗原或半抗原第3节均相酶免疫测定基本原理①待测Ag+检测抗体→结合+酶标Ag→游离的多结合的少②待测Ag+检测抗体→不结合+酶标Ag→结合的多游离的少结合者活性被抑制，游离者活性正常加底物观察颜色变化判断结果一、酶扩大免疫测定技术（enzyme-multipliedimmunoassaytechnique，EMIT）•基本原理:半抗原与酶结合成酶标半抗原，酶有活性。但酶标半抗原与抗体结合后，酶与抗体密切接触，使酶的活性中心受影响而活性被抑制。若待测标本中含相应抗原，则结合抗体，可竞争抑制抗体与酶标半抗原结合，加底物显色有变化。结合在酶上的半抗原游离的半抗原半抗原的抗体酶标记的半抗原待测的标本(可能有游离的半抗原)底物+未与抗体结合的酶标记半抗原使底物显色二、克隆酶供体免疫测定（clonedenzymedonorimmunoassay,CEDIA）大片段称为酶受体（EnzymeAcceptor)小片段称为酶供体（EnzymeDonor）ED标记的抗原有活性的酶有活性的酶+活性酶标本中的抗原ED标记的抗原①②利用重组DNA技术制备为β-半乳糖苷酶的两个片段：大片段称为酶受体（enzymeacceptor,EA），小片段称为酶供体（enzymedonor,ED），两个片段本身均不具酶活性，但结合在一起就具有酶活性，利用这一特性建立的均相酶免疫测定称为克隆酶供体免疫测定。(CEDIA)。CEDIA的反应模式为竞争法。•基本原理：标本中的抗原和ED标记的抗原与特异性抗体竞争结合，形成两种抗原抗体复合物。ED标记的抗原与抗体结合后由于空间位阻，不能再与EA结合。反应平衡后，剩余的ED标记抗原与EA结合，形成具有活性的酶，加入底物测定酶活力，酶活力的大小与标本中抗原含量呈正比。第4节其他酶标记免疫测定技术（一）、常用的固相膜：尼龙膜、聚偏氟乙（PVDF)、硝酸纤维素膜（NC)等。（二)、常用固相膜免疫测定的标志物：酶、胶体金、彩色胶乳和胶体硒。固相膜免疫测定法蛋白的结合力：吸附力强，比ELISA吸附力强。高度敏感性均一性：要具有良好的均一性，才能保证检测结果的准确性1.斑点酶免疫吸附试验基本原理与常规ELISA相同，不同之处在于Dot-ELISA使用吸附蛋白质能力很强的NC膜为固相载体，底物经酶反应后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。斑点-酶联免疫吸附试验比ELISA灵敏性高6-8倍，试剂用量比ELISA节省5-10倍。基本原理与常规ELISA相同，不同之处在于Dot-ELISA使用吸附蛋白质能力很强的NC膜为固相载体，底物经酶反应后形成有色的沉淀物，使NC膜染色。2.免疫印迹试验优点：能分析不能用其他的免疫化学技术进行研究的蛋白样品，如，不能标记的蛋白或不溶于温和提取缓冲液的蛋白等。特点：分析容量大、敏感性高、特异性强原理抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动。将在凝胶中已经分离的蛋白质条带转移至NC腹上，选用低电压(100v)和高电流(1～2A)，通电45min转移即可完成。印有蛋白条带的NC膜依次与特异性抗体和酶标二抗作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。阳性反应的条带染色清晰，根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。亲合素(Avidin)EAbAb-E生物素(Biotin)Ab-BB-E放大作用比普通ELISA敏感4-16倍生物素-亲和素标记技术（一）生物素和亲和素的特点1．生物素(biotin，B)又称维生素H动、植物组织中广泛分布,卵黄和肝含量高MW244.31kD.I环为咪唑酮环，可与亲合素结合Ⅱ环为噻吩环，C2上戊酸侧链的未端羧基是结合抗体等生物大分子的唯一结构I咪唑酮环Ⅱ噻吩环羧基2．亲和素(avidin，A)亲合素（Avidin）也称抗生物素或卵白素，提取自卵白，分子量68KD（１种大分子量蛋白）；由4个相同的亚基组成，每个亚基可结合1个生物素或酶等标记物；生物素性质稳定，耐热，对酶消化不敏感；生物素和亲合素的结合特异、稳定，亲和力较抗原抗体的结合高1万倍。3．链霉亲和素(streptavidin，SA)链霉亲合素（streptomycesavidinii,SA）:由链霉菌分泌的一种蛋白，可与生物素高亲合力结合。由四条序列相同的肽链组成，每条肽链都可结合1个生物素。由于等电点低，因此表面带正电荷少，因此与聚苯乙烯载体的静电吸附少，检测中出现的非特异性结合明显少于亲