CHAPTER 8 分子克隆载体

分子克隆载体ThevectorsinthemolecularcloningChapter8Chapter8分子克隆载体1.质粒载体2.噬菌体载体3.人工染色体载体4.表达载体Vector1.载体：将外源DNA或基因携带进入宿主细胞的工具称为载体2.特征：①能够自我复制(具备复制原点)②酶切位点③选择标记④较高的拷贝数载体介绍plasmid:small,extrachromosomalcircularmolecules,from2to~200kbinsize,whichexistinmultiplecopieswithinthehostcells.第一节质粒载体1.质粒的复制复制起始区和顺式作用元件2.质粒的拷贝数严谨型和松弛型一、质粒的基本特征3.质粒的不相容性两个质粒在同一宿主中不能共存(不能共用同一复制系统)。4.转移性质粒可通过细菌结合的作用转移到新宿主细胞内。一、质粒的基本特征1.选择标记基因用于鉴别目的DNA的存在，将成功转化了载体的宿主挑选出来。最广泛使用的是抗生素基因：ampr，tetr，kanr，neor等。二、标记基因2.筛选标记基因用于区别重组质粒与非重组质粒，当一个外源DNA片段插入到一个质粒载体上时，可通过该标记来筛选插入了外源片段的质粒。二、标记基因选择标记和筛选标记(1)α-互补是指lacZ(β-半乳糖苷酶)基因上缺失近操纵基因区段(Operator区)的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶的突变体之间实现互补。2.筛选标记基因当载体带有lacZ调节序列和编码β-半乳糖苷酶N末端146个氨基酸的序列，而宿主中该部分序列缺失其他部分完整时，虽然宿主编码的或质粒编码的片段本身都没有活性，但它们相互协作则可形成有酶活性的蛋白，在诱导物IPTG存在下，细菌在含色素底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-gal)培养基上形成蓝色菌落，当在质粒上插入外源DNA，使β-半乳糖苷酶N末端失活，从而就不能进行α-互补，因此带有重组质粒的细菌产生白色菌落。α-互补原理Recreatedvector:bluetransformantsRecombinantvector:containinginsertedDNA:whitetransformantsRecreatedvector(noinsert)Recombinantvector(containinsert)lac操纵子调节序列β-半乳糖苷酶N末端146个氨基酸序列IPTG载体上能合成N末端β-半乳糖苷酶缺陷型细胞有活性的β-半乳糖苷酶互补在含X-gal培养基上显蓝色菌落插入外源DNAβ-半乳糖苷酶IPTG载体上不能合成N末端β-半乳糖苷酶缺陷型细胞不互补无活性的β-半乳糖苷酶在含X-gal培养基上显白色菌落(2)插入失活质粒pBR322具有tetr基因和ampr基因，当外源DNA插入tetr基因后，导致tetr基因失活，只有ampr抗性。1.克隆载体主要用于克隆和保存DNA片段。2.表达载体来源于克隆载体，增加了强启动子等元件，有利于表达产物分泌、分离、纯化三、质粒载体的种类克隆载体克隆载体表达载体第二节λ噬菌体载体1.基因组大小：双链DNA，48,502bp2.感染宿主后进入：容原状态，将λ噬菌体基因组DNA通过位点专一性重组整合到宿主的染色体中，并随宿主的繁殖传递给子代。裂解循环，大量复制并装配成子代λ噬菌体颗粒，导致宿主细胞裂解。一、λ噬菌体的分子生物学1.λphageLifecycle•virusesthatcaninfectbacteria.•48.5kbinlength•Linearorcirculargenome(cosends)λphageLyticphase(Replicateandrelease)Lysogenicphase(integrateintohostgenome)λreplacementvector●ReplacethenonessentialregionofthephagegenomewithexogenousDNA(~20kb)●hightransformationefficiency(1000-timehigherthanplasmid)λreplacementvector2.PackingwithamixtureofthephagecoatproteinsandphageDNA-processingenzymes1.Ligation3.InfectionandformationofplaquesPlaques(噬菌斑):theclearareaswithinthelawnwherelysisandre-infectionhavepreventedthecellsfromgrowing.RecombinantlDNAmaybepurifiedfromphageparticlesfromplaquesorfromliquidculture.主要利用λ噬菌体的生物学特性来作筛选标记。1、基因组大小2、lacZ基因3、cI基因失活4、Spi筛选二、λ噬菌体载体的筛选标记1．基因组大小重组λ噬菌体的基因组DNA太大或太小会影响其存活能力。当基因组DNA长度为野生型λ噬菌体基因组DNA的78～105%时，不会明显影响存活能力。野生型λ噬菌体基因组DNA为48kb，若用外源DNA片段完全替换可取代区，外源DNA片段的大小将在9-23kb范围内。二、λ噬菌体载体的筛选标记2．lacZ基因lacZ基因也可用于λ噬菌体载体，通过插入或替换载体中的β-半乳糖苷酶基因片段，在IPTG/X-gal平板上可通过噬菌斑的颜色，筛选重组噬菌体。二、λ噬菌体载体的筛选标记3．基因cⅠ失活基因cⅠ是λ噬菌体的抑制基因，全面抑制并阻断基因的表达。cⅠ基因的表达促进λ噬菌体进入容原状态，基因cⅠ产物活性受到影响会促进λ噬菌体进入裂解循环。如果外源DNA片段插入基因cⅠ中，将高频率地使hfl突变E.coli进入裂解生长状态。在构建基因文库时，可提高排除非重组噬菌体的效率，从而降低对基因文库进行筛选的劳动强度。二、λ噬菌体载体的筛选标记4．Spi筛选野生型λ噬菌体在带有P2原噬菌体的容原性E.coli中的生长会受到限制的表型，称作Spi+，即对P2噬菌体的干扰敏感。如果λ噬菌体缺少两个参与重组的基因red和gam，同时带有chi位点，并且宿主菌为rec+，则可以在P2容原性E.coli中生长良好，λ噬菌体的这种表型称作Spi-。因此，通过λ噬菌体载体DNA上的red和/或gam基因的缺失或替换，可在P2噬菌体溶源性细菌中鉴别重组和非重组λ噬菌体。二、λ噬菌体载体的筛选标记1、通过裂解过程增殖载体2、载体与外源DNA的酶切3、外源DNA与载体的连接4、重组噬菌体的体外包装5、包装噬菌体颗粒的感染6、筛选三、λ噬菌体载体的克隆原理及步骤第三节人工染色体载体1.黏粒载体2.酵母人工染色体载体(YAC)3.细菌人工染色体载体(BAC）4.P1人工染色体载体关于人工染色体载体1.人工染色体载体：利用染色体的复制元件来驱动外源DNA片段复制的载体。2.特征：插入片段的大小接近染色体大小(40kb-400kb)。1.黏粒的结构包括质粒复制起点(ColE1)、抗性标记(ampr)、cos位点，大小5-7kb。2.用途①克隆较大片段的DNA，可达45kb②可在单个重组体种克隆和增殖完整的真核基因③可克隆和分析组成某一基因家族的真核DNA区段(一)黏粒的结构特征和用途一、黏粒载体1.外源片段与载体连接。黏粒载体cos位点通过黏端退火后，再与外源片段相间连接成多联体。当多联体与l噬菌体包装蛋白混合时，l噬菌体A基因蛋白的末端酶功能将切割两个cos位点，并将两个同方向cos位点之间的片段包装到l噬菌体颗粒中去。2.重组噬菌体颗粒感染大肠杆菌时，线状的重组DNA就象l噬菌体DNA一样被注入细胞并通过cos位点环化，这样形成的环化分子含有完整的黏粒载体，可象质粒一样复制并使其宿主获得抗药性。3.再用带有含抗生素的培养基挑选重组黏粒的细菌。(二)黏粒载体的工作原理二、酵母人工染色体载体YAC人工染色体载体是利用酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）的染色体的复制元件构建的载体，其工作环境也是在酿酒酵母中。酿酒酵母的形态为扁圆形和卵形，生长的代时为90分钟；含16条染色体，其大小为225-1900kb，总计有14×106bp；具真核mRNA的加工活性。在YAC载体中最常用的是pYAC4。由于酵母的染色体是线状的，因此其在工作状态也是线状的。但是，为了方便制备YAC载体，YAC载体以环状的形式存在，并增加了普通大肠杆菌质粒载体的复制元件和选择标记，以便保存和增殖。1．YAC人工染色体载体的复制元件和标记基因YAC载体的复制元件是其核心组成成分，其在酵母中复制的必需元件包括：复制起点序列即自主复制序列(autonomouslyreplicatingsequence，ARS)、用于有丝分裂和减数分裂功能的着丝粒(centromere,CEN)和两个端粒(TEL)。1．YAC人工染色体载体的复制元件和标记基因(1)端粒重复序列(telomericrepeat，TEL)：定位于染色体末端一段序列，用于保护线状的DNA不被胞内的核酸酶降解，以形成稳定的结构。(2)着丝粒(centromere，CEN)：有丝分裂过程中纺锤丝的结合位点，使染色体在分裂过程中能正确分配到子细胞中。在YAC中起到保证一个细胞内只有一个人工染色体的作用。如pYAC4使用的是酵母第四条染色体的着丝粒。(3)自主复制序列(autonomouslyreplicationsequences，ARS)一段特殊的序列，含有酵母菌中DNA进行双向复制所必须的信号。YAC载体结构主要采用营养缺陷型基因，如色氨酸、亮氨酸和组氨酸合成缺陷型基因trp1、leu2和his3、尿嘧啶合成缺陷型基因ura3等，以及赭石突变抑制基因sup4。与YAC载体配套工作的宿主酵母菌(如AB1380)的胸腺嘧啶合成基因带有一个赭石突变ade2-1。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。YAC载体的选择标记2．YAC载体的工作原理当用BamHⅠ切割成线状后，形成一个微型酵母染色体，包含染色体复制的必要顺式元件。对于BamHⅠ切割后形成的微型酵母染色体，当用EcoRⅠ或SmaⅠ切割抑制基因sup4内部的位点后形成染色体的两条臂，与外源大片段DNA在该切点相连就形成一个大型人工酵母染色体，通过转化进入到酵母菌后可象染色体一样复制，并随细胞分裂分配到子细胞中去，达到克隆大片段DNA的目的。装载了外源DNA片段的重组子导致抑制基因sup4插入失活，从而形成红色菌落；而载体自身连接后转入到酵母细胞后形成白色菌落。YAC文库装载的DNA片段的大小一般可达200-500kb，有的可达1Mb以上，甚至达到2Mb。2．YAC载体的工作原理三、细菌人工染色体载体基于大肠杆菌的F质粒构建的高容量低拷贝质粒载体。F质粒是一个约100kb的质粒，编码60多种参与复制、分配和结合过程的蛋白质。BAC大小7.5kb，复制单元来自F质粒，包括严谨型控制的复制区oriS、启动子DNA复制的由ATP驱动的解旋酶RepE，以及3个确保低拷贝并使质粒精确分配到子代细胞的基因parA、parB、parC。1．BAC载体及其特点①低拷贝可避免嵌和体的产生②减少外源基因的表达产物对细胞的毒副作用③标记基因为氯霉素抗性基因④可通过α-互补筛选重组子⑤设计了用于回收克隆DNA的NotI酶切位点和用于克隆DNA片段体外转录的SP6启动子和T7启动子⑥可插入片段平均120kb，最大可达300kbBAC载体特点BAC工作原理与其他常见质粒载体相似。不同之处：①大片段DNA需要脉冲场凝胶电泳分离。②拷贝数小，制备难度大。解决方案？BAC文库构建的关键步骤：①大