第15章 免疫细胞标志与功能检测技术

第十五章免疫细胞标志和功能检测技术医学技术学院免疫教研室齐齐哈尔医学院免疫掌握：免疫细胞的分离;淋巴细胞功能检测熟悉：免疫细胞表面标志和功能检测的临床应用;淋巴细胞表面标志及亚群分类；了解：其他免疫细胞功能检测技术；检测的临床应用。齐齐哈尔医学院免疫一、免疫细胞的分离二、淋巴细胞标志及亚群分类三、抗原提呈细胞的表面标志四、淋巴细胞的功能检测五、其他免疫细胞功能检测技术六、免疫细胞表面标志和功能检测的临床应用齐齐哈尔医学院免疫齐齐哈尔医学院免疫一、外周血单个核细胞分离二、淋巴细胞的分离三、T、B细胞和T细胞亚群的分离四、不同分离方法的评价第一节免疫细胞的分离掌握齐齐哈尔医学院免疫外周血单个核细胞(perpheralbloodmononuclearcells,PBMC)：包括淋巴细胞和单核细胞。一、外周血单个核细胞分离掌握齐齐哈尔医学院免疫1.不同细胞密度不同2.不同细胞表面生物学特性不同3.不同细胞表面分化抗原不同细胞分离基本原理了解齐齐哈尔医学院免疫红细胞和粒细胞密度为1.092-1.093单个核细胞密度为1.075-1.090选择比重为1.075-1.090介质分离PBMC不同细胞密度不同熟悉齐齐哈尔医学院免疫对分离介质的要求1.对细胞无毒2.基本等渗3.不溶于血浆等分离物质4.有要求的比重2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1份34%泛影葡胺比重为1.077±0.002熟悉齐齐哈尔医学院免疫聚蔗糖泛影葡胺--Ficoll分离液原理：单次差速密度梯度离心的分离法组成：2份6%聚蔗糖蒸馏水溶液+1份34%泛影葡胺生理盐水溶液。比重：1.077±0.001(最佳)掌握齐齐哈尔医学院免疫1.077±0.001的分层液可将细胞分离红细胞：1.093粒细胞：1.092单个核细胞1.076—1.090齐齐哈尔医学院免疫齐齐哈尔医学院免疫密度梯度离心(Ficoll)离心细胞纯度95%；细胞收率80%；淋巴细胞90%--95%齐齐哈尔医学院免疫1.贴壁粘附法2.吸附柱过滤法:将PBMC加入葡聚糖凝胶SephadexG-10中，从柱上洗脱下来的主要是淋巴细胞。3.Percoll分离液法：经聚乙烯吡咯烷酮（PVP)处理的硅胶颗粒。目的--去除单核细胞二、淋巴细胞分离掌握齐齐哈尔医学院免疫死细胞、血小板单核细胞淋巴细胞粒细胞红细胞Percoll：经聚乙烯吡咯烷酮（PVP)处理的硅胶颗粒。齐齐哈尔医学院免疫(一)磁性微球分离法(二)荧光激活细胞分离仪分离法三、T、B细胞和T细胞亚群的分离熟悉磁珠高分子材料齐齐哈尔医学院免疫磁珠大小可以选择齐齐哈尔医学院免疫磁性微球分离法细胞分选过程齐齐哈尔医学院免疫齐齐哈尔医学院免疫齐齐哈尔医学院免疫大小免疫磁珠分离细胞的特点比较比较项目大磁珠小磁珠对细胞的影响对细胞造成机械压力，影响其生物学活性，不利于分离后培养。对细胞温和，不影响分离细胞的后续培养。对流式细胞仪的影响阻塞流式细胞仪的喷嘴，影响散射光。可直接上流式细胞仪检测，不影响散射光。分离条件要求技术简单，分离可在试管中完成。需要很强的磁场来分离细胞。收率得率高。得率不高。纯度纯度低。纯度高。分离时间分离速度快。分离速度慢。分离成本成本低。需要很强的磁场来分离，需要一次性分离柱，不能在普通试管齐齐哈尔医学院免疫免疫磁珠细胞分选装置齐齐哈尔医学院免疫全自动细胞分选系统齐齐哈尔医学院免疫荧光激活细胞分离仪分离法齐齐哈尔医学院免疫流式细胞分析仪齐齐哈尔医学院免疫四、不同细胞分离方法的综合评价早期：根据不同免疫细胞的物理属性和生物学属性进行分离近期：利用细胞表面标志进行分离了解齐齐哈尔医学院免疫1.分离外周血单个核细胞，单次差速密度梯度离心法常用分层液是（）A明胶B右旋糖酐CFicoll分层液DPercoll分层液E葡聚糖2.Ficoll液单次密度梯度离心后外周血细胞分布由上至下依次为（）A单个核细胞、血小板和血浆、粒细胞、红细胞B血小板和血浆、粒细胞、单个核细胞、红细胞C血小板和血浆、单个核细胞、粒细胞、红细胞D血小板和血浆、单个核细胞、红细胞、粒细胞E血小板和血浆、红细胞、单个核细胞、粒细胞用玻璃纤3.维或葡聚糖凝胶Sephadex-G10柱分离细胞时，从柱上洗脱下的细胞主要是()A．粒细胞B．淋巴细胞C．单核细胞D．T细胞E．B细胞CCB齐齐哈尔医学院免疫4.采用Ficoll密度梯度分离法分离得到的细胞主要为（）A单核细胞和粒细胞B单核细胞C淋巴细胞D淋巴细胞和单核细胞E淋巴细胞和粒细胞5.Percoll分离液的主要成分是()A．聚蔗糖B．泛影葡胺C．聚乙二醇D．聚乙烯吡咯烷酮E．经聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒6.分离人外周血淋巴细胞分层液的最佳密度为()A.1.030B.1.035C.1.092D.1.020E.1.0777.Ficoll淋巴细胞分离液的主要成分是()A．聚蔗糖B．泛影葡胺C．聚乙二醇D．聚蔗糖+泛影葡胺E．聚蔗糖+聚乙二醇DEED齐齐哈尔医学院免疫第二节淋巴细胞标志及亚群分类齐齐哈尔医学院免疫细胞表面分化抗原(ClusterofdifferentiationCD)CD1a------CD350齐齐哈尔医学院免疫(一)CD3+CD4+CD8-辅助性T细胞(Th)CD3+CD4+CD30-Th1CD3+CD4+CD30+Th2(二)CD3+CD4-CD8+细胞毒性T细胞(CTL)(三)调节性T细胞CD4+CD25+Foxp3+Tr1–IL-10Th3–TFG-β一、T细胞表面标志及亚群熟悉CD4+Th细胞亚群分化的调节作用齐齐哈尔医学院免疫CD抗原CD2CD3CD4CD8CD25CD28CD40L特异性全部T细胞和部分NK细胞(E受体)成熟T细胞(特征性标志)辅助性T细胞(HIV受体)细胞毒性T细胞活化T细胞(IL-2R)T细胞活化T细胞T细胞表面主要CD抗原及其特性齐齐哈尔医学院免疫mIg(鉴定B细胞的指标)Fc受体补体受体EB病毒受体CD分子:CD19小鼠红细胞受体二、B细胞表面标志熟悉分类:B1(CD19+CD5+)B2(CD19+CD5-)性质B-1B-2产生时间更新方式自发性Ig产生特异性分泌的Ig类别体细胞突变频率对TI抗原的应答对TD抗原的应答胎儿期自我更新高低IgM为主低/无是可能出生后骨髓产生低高IgG为主高可能是性质B-1B-2产生时间更新方式自发性Ig产生特异性分泌的Ig类别体细胞突变频率对TI抗原的应答对TD抗原的应答胎儿期自我更新高低IgM为主低/无是可能出生后骨髓产生低高IgG为主高可能是性质B-1B-2产生时间更新方式自发性Ig产生特异性分泌的Ig类别体细胞突变频率对TI抗原的应答对TD抗原的应答胎儿期自我更新高低IgM为主低/无是可能出生后骨髓产生低高IgG为主高可能是B-1细胞和B-2细胞的异同齐齐哈尔医学院免疫CD抗原CD21CD35CD40CD80/86CD19/CD5特异性EB病毒受体活化B细胞与CD40L结合活化B细胞与T细胞CD28结合，活化T细胞B1双阳；B2仅为CD19+B细胞表面主要CD抗原及其特性齐齐哈尔医学院免疫CD3-CD56+CD16+三、NK细胞表面标志（naturekillercell,NK)熟悉复习1.对细胞液分离的要求？2.从PBMC中得到淋巴细胞的方法？3.成熟T细胞表面主要标志？4.B细胞根据什么主要标志分为何种亚群？齐齐哈尔医学院免疫抗原提呈类细胞表面标志第三节抗原提呈细胞的表面标志CD1a,CD11c,CD83齐齐哈尔医学院免疫一、单核-吞噬细胞系统组织部位细胞名称骨髓干细胞—单核母细胞—前单核细胞骨髓和血液单核细胞各种组织组织细胞（结缔组织）,枯否细胞（肝）（巨噬细胞）破骨细胞（骨）、小胶质细胞（神经组织）、表面标志:CD14熟悉齐齐哈尔医学院免疫二、树突状细胞（dendriticcell)抗原提呈能力最强DC的共同特征包括：①形态上呈树突状，胞质内存在特异性Birbeck颗粒状结构②表达CD1a、高水平MHC-Ⅱ类抗原和多种辅助分子③吞噬功能较低④可有效诱导巢居的静息性幼稚T细胞发生增殖熟悉齐齐哈尔医学院免疫1.用抗人CD3单克隆抗体检测T淋巴细胞，其结果代表（）AT淋巴细胞总数BTh细胞数CTs细胞数DCD4T细胞数ECD8T细胞数2.下列指标可以评价AIDS病人的细胞免疫功能的是（）ACD2/CD3细胞比值BCD3/CD4细胞比值CCD3/CD8细胞比值DCD4/CD8细胞比值ECD2/CD4细胞比值3.能与SRBC结合形成E花环的细胞主要是()A．T细胞B．B细胞C．单核细胞D．粒细胞E．血小板ADA齐齐哈尔医学院免疫4.B细胞重要表面标志不包括（）A膜免疫球蛋白（SmIg）BEB病毒受体CE受体D补体受体D小鼠红细胞受体5.NK细胞特有的表面抗原是()A.CD2B.CD16C.无特异的表面抗原D.CD23E.CD566.单核巨噬细胞系统细胞的表面标志()A．CD2B．CD16C．CD14D．CD16E．CD197.外周成熟的休止B细胞分如下亚群()A.CD4+细胞B.CD4-细胞C.CD8+细胞D.CD8-细胞E.B1细胞和B2细胞CCCE齐齐哈尔医学院免疫第四节淋巴细胞功能检测T细胞（负责细胞免疫功能）B细胞（执行体液免疫功能）NK细胞（非特异性免疫作用）齐齐哈尔医学院免疫一、T细胞功能检测(一)T细胞增殖试验(二)抗原特异性T细胞增值试验(三)MHC-肽四聚体技术(四)T细胞分泌功能测定(五)T细胞介导的细胞毒试验(六)体内试验齐齐哈尔医学院免疫1.原理淋巴细胞DNA合成分化母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松（一）T淋巴细胞增殖试验---T细胞转化实验掌握齐齐哈尔医学院免疫T细胞外来物质细胞内大分子物质的合成增加T细胞形态变化丝裂原：非抗原性刺激物PHA、ConA、PWM抗原性刺激物：PPD(purifiedproteinderivative)同位素法形态法齐齐哈尔医学院免疫标本：外周血单个核细胞37℃72h+取培养细胞涂片染色镜检观察细胞形态学改变PHA无PHA刺激物：常用PHA（1）形态学检查法齐齐哈尔医学院免疫未转化和转化淋巴细胞的形态特征转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞过渡型细胞大小(直径μm)12-2012-166-8核大小、染色质增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、1-4个有或无无有丝分裂有或无无无胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色浆内空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无齐齐哈尔医学院免疫齐齐哈尔医学院免疫淋巴细胞标志及功能检测龚道科2002.4齐齐哈尔医学院免疫正常转化率:60%-80%;小于50%为降低齐齐哈尔医学院免疫优点：形态学方法简便易行，适于基层实验室应用。缺点：判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性差。方法学评价：齐齐哈尔医学院免疫外周血单个核细胞37℃56h+收集培养细胞液体闪烁器计数cpm加入3H-TdRPHA无PHA37℃16h（2）3H-TdR掺入法齐齐哈尔医学院免疫优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观强，重复性好。缺点：但需一定设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。SI=刺激指数PHA刺激管cpm均值对照管cpm均值齐齐哈尔医学院免疫(3)MTT比色法MTT（噻唑盐）在活细胞内被线粒体琥珀酸脱氢酶还原成蓝黑色(甲臢）物质，与细胞增殖呈正相关。齐齐哈尔医学院免疫方法学评价：优点：操作简便，无放射性污染缺点：敏感性不及放射性核素法齐齐哈尔医学院免疫感染性疾病，T细胞会形成对病原微生物的免疫记忆，在体外分离到T细胞后，培养增殖T细胞的同时加入相应病原的特异抗原进行刺激，激活该细胞的记忆，有记忆的细胞会分泌γ-干扰素，通过检测γ-干扰素的量可以反映T细胞情况。（二）抗原特异性T细胞增值试验了解齐齐哈尔医学院免疫通过TCR与MHC-肽的特异性相互作用，来检测抗原特异的T细胞，了解机体的免疫状况。（三）MHC-肽四聚体技术了解齐齐哈尔医学院免疫免疫学、细胞生物学及分子生物学技术分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平。（四）T细胞分泌功