《诊断学》 第一节 基因诊断

1第一节基因诊断分子生物学是当前生命科学中发展最快并正在与其他学科广泛交叉与渗透的重前沿领域。近年来分子生物学理论和技术不断应用于临床，在疾病的诊断、治疗和预防等方面发挥了重要的作用，并显示出了无限的潜力。分子生物学与临床医学的广泛交叉和渗透就产生了分子医学。20世纪70年代末，美国科学家Kan等首次应用DNA分子杂交技术成功地对镰形细胞贫血症进行了基因诊断，这标志着基因诊断的开始。一、基因诊断的含义基因诊断是在基因水平上对疾病或人体的状态进行诊断。它是以遗传物质（如：DNA或RNA）为检查对象，利用分子生物学技术，通过检查基因的结构或表达量的多少来诊断疾病的方法。这里的遗传物质既可是外源性基因（如侵入机体的病毒、细菌、支原体等病原微生物的基因），也可以是内源性的基因（如癌基因、抑癌基因或突变的基因等）。因此基因诊断（分子生物学诊断）主要是对遗传物质结构改变与否、表达量变化与否进行检测，主要用于感染性疾病病原体诊断、先天遗传性疾病诊断、基因突变性疾病（如肿瘤）诊断、产前诊断、亲子鉴定和法医物证等。基因诊断的内容主要有：（1）基因突变检测：如点突变、基因片段的缺失或插入、基因重排等不同类型基因突变的检测。（2）基因连锁分析：临床的一些疾病的致病基因尚不清2楚，很难用基因突变的检测诊断。因此对这些遗传疾病采用基因连锁分析。（3）基因表达分析：如mRNA定量检测及mRNA长度分析等。mRNA检测在基因表达水平上为基因功能是否正常提供了直接依据。（4）病原体诊断：即外来入侵病原微生物遗传物质的检测。二、基因诊断在诊断学中的位置传统的疾病诊断方法主要是以疾病的表型改变为依据，如症状、体征、物理检查、实验室检查，然而表型的改变在许多情况下不是特异的，.同一种表型可能在多种疾病中出现，而且表型往往在疾病发生一定时间后才出现，因此常不能及时作出明确的诊断。研究发现各种表型的改变是由基因异常造成的，也就是说基因的改变是引起疾病的根本原因。基因诊断是病因的诊断，既特异又灵敏，可以揭示尚未出现症状时与疾病相关的基因状态，从而可以对表型正常的携带者及某种疾病的易感者做出诊断和预测，特别对确定有遗传疾病家族史的个体或产前的胎儿是否携带致病基因的检测具有指导意义。三、基因诊断的常用技术分子生物学技术是基因诊断的主要技术。近年来随着分子生物学技术日新月异，以核酸分子杂交和聚合酶链反应3（PCR）为核心发展起来了多种方法已被广泛用于基因诊断，如PCR一单链构象多态性（singlestrandconformationpo1ymorphism，sscp）、限制性片段多态性（restrictionfragmentlengthpo1ymorphism，RFLP）、等位基因特异性寡核苷酸分第十章其他检测析（allele-specifico1igonucleotide，ASO）、基因芯片技术（genechip）、逆转录PCR（re-versetranscription-PCR）、Southern印迹杂交（Southernblotting）、Northern印迹杂交（Northernblotting）、斑点杂交（dotblotting）和原位杂交（insituhybridization，ISH）等。（一）核酸分子杂交技术核酸分子杂交是指两条互补单链核酸（DNA或RNA）在一定条件下按碱基互补原则退火形成双链的过程。它是研究核酸结构与功能的常用技术。杂交的双方是探针与待检核酸，杂交后形成的双链分子称为杂交分子（DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA）。分子杂交的方法多种多样，其共同点是：①应用了核酸序列的复性原理；②都采用了标记探针。探针就是同位素或非同位素（如：生物素或荧光染料等）标记的短片段特异DNA或RNA。常用的核酸分子杂交技术有：1．Southern印迹杂交Southern印迹杂交又称DNA印迹，是英国科学家Southern于1975年发明的一种特定检测DNA片段的方法。其基本原理是：将基因组DNA用一种或几种限制性内切酶消化成大小不同的片段，消化后用电泳的方法将4这些DNA按大小不同进行分离，分离后通过原位变性，将其转印到固相支持物上，如：硝酸纤维素薄膜，再应用特异的同位素或非同位素标记的DNA或RNA探针进行杂交，然后通过对杂交信号的检测来确定探针互补条带的位置。基因的缺失或突变可能导致带的缺失或位置改变。Southern印迹的转印方法有毛细管虹吸印迹法、电转法、真空转移法。Southern印迹杂交的主要步骤是：从细胞中分离提纯基因组DNA→用限制酶消化基因组DNA获得长短不同的酶切片段→通过凝胶电泳将这些片段按大小分离→将凝胶上的DNA片段变性后原位转移到固相支持物上→用放射性核素或非放射性核素标记的探针与之杂交→通过放射自显影或相应显色方法显示杂交信号。Southern印迹杂交在其他分子生物学方法出现之前曾广泛用于科研和临床诊断中。临床上主要用于进行疾病的RFLP连锁分析、基因缺失诊断。现在一些动态突变疾病的诊断也可先用PCR扩增后再通过Southern印迹杂交来进行。由于DNA印迹杂交技术相对较烦琐，需要的DNA量较大（一边需要1～5μg），在取材量受限的疾病诊断中已被其他方法如PCR取代。2．Northern印迹杂交Northern印迹杂交是一种研究RNA的方法，可用于测定细胞的总RNA或mRNA分子量的大小。其基本原理和基本过程与Southern杂交相似，不同之处在于：①Northern印迹杂交检测的对象为RNA，而Southern5印迹杂交检测的是DNA。②Northern印迹杂交是在RNA电泳前对其进行变性，并在电泳时加入变性剂，使RNA电泳时保持变性状态，而Southern印迹杂交是在电泳后进行变性。3．斑点杂交斑点杂交（dotblotting）即狭缝杂交，其基本原理将被检样品点到一张硝酸纤维素膜上，烘烤固定，预杂交后，经中和、洗脱、干燥，再将其和探针放入复性缓冲溶液中缓缓复性，洗涤干燥后进行放射自显影，观察结果。若杂交样品为RNA需在点样前对RNA进行变性后再进行点样，若为DNA在点样后对膜进行变性处理。斑点杂交是一种快速、简便、既可检测DNA又可检测RNA的方法，可同时检测多个样品，既可进行定性还可以进行半定量。这种方法可初步探测被测样品中是否含有一种特殊的基因或序列，且可用来分析样品之间的同源性。4．原位杂交原位杂交（insituhybridization，ISH）就是在保持细胞基本形态的情况下，用放射性核素或非放射性核素标记的探针与细胞内的DNA或RNA进行杂交。若探针是同位素标记，杂交后需用X光片进行放射自显影，然后观察曝光点在组织或染色体分裂象上的相对位置。若探针用荧光标记，杂交后用荧光显微镜直接观察，现已发展了多色荧光技术，因此可同时检测多种DNA或RNA的情况。原位杂交由于是原位检测，因此在对特定DNA或RNA进行检测的同时还可对其进行细胞及基因组内定位。6（二）DNA测序DNA测序（DNAsequencing）即DNA一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。由于临床上进行各种突变分析的最终目的是获得突变信息，即确定具体的突变类型，因而不管先通过何种方法进行突变筛查，最终都会落实到DNA测序上。DNA测序能直观地反映出DNA序列的变化，因此是诊断未知突变基因的最直接的方法，在遗传病和肿瘤的诊断、法医学的鉴定中具有非常重要的意义。DNA序列测定常用方法有以下3种：1．双脱氧链终止法目前应用最多的快速测序技术是Sanger等1977年提出的双脱氧链终止法（chainterminationmethod）。双脱氧链终止法的基本原理是：DNA聚合酶利用单链DNA作为模板，准确合成互补DNA链，它不仅可以以单脱氧核苷酸（dNTP）为底物，而且可以以双脱氧核苷酸（ddNTP）为底物，ddNTP若在合成过程中3'末端掺入了ddNTP，DNA链的生长将会被终止，因此生成一系列不同长度的DNA片段。其基本操作步骤（图4-10-1）：共设4个反应管，各管中同样加入DNA模板、DNA聚合酶、放射性核素32P标记的引物、4种dNTP，将四种不同的ddNTP（ddATP、ddTTP、ddGTP、ddCTP）分别加入相应管进行温育，将四管反应产物平行加到同一变性凝胶上作电泳分离，通过放射自显影术可获得一系列全部以3'--末端ddNTP为终止碱基的长度不等的DNA片段的电泳7谱带，通过电泳谱带可直接读出DNA的核苷酸顺序。2．化学降解法化学降解法（chemicaldegradationsequencing）由Maxam&Gibert于1977年提出，其原理是不同的碱基（G，A＋G，C＋T，C）可被不同的化学试剂特异地修饰，使相应的糖苷键变得不稳定，造成碱基的特异性切割，产生四组不同长度的DNA链的反应混合物，反应后经聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影也可读出DNA的序列。常用的化学试剂有硫酸二甲酯和肼。化学降解反应包括碱基的修饰、将修饰的碱基从其糖环上脱落、DNA在失去碱基的糖环处断8裂。化学法的优点是模板不需体外酶促反应，只要末段标记的DNA片段，无论单链或双链，分别标记3’端和5’端可进行双侧读取检测短的寡核苷酸片段；其缺点是方法复杂费时，末段标记比活性低。3．自动测序技术自动测序技术采用自动化测序仪进行，其原理同双脱氧链终止法。不同的是自动测序技术是用四种不同的荧光染料分别标记ddNTP或标记引物，采用激光扫描器同步扫描，计算机进行阅读和编辑，电泳结束后，结果以彩图和序列形式打印出来。自动测序技术结果清晰、准确、分辨率高，特别是近年来采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酞胺凝胶电泳进行DNA分离，大大提高了测序的速度和测速的功能。（三）聚合酶链反应聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）是利用DNA聚合酶（如:TaqDNA）在体外催化一对引物间的特异DNA片段合成的基因体外扩增技术。PCR反应体系包括:模板、引物、DNA聚合酶、dNTP和PCR反应缓冲液。基因诊断时模板一般是待测核酸分子:DNA可直接用于反应，而RNA则需要用逆转录酶逆转录成为cDNA，然后用作聚合酶反应的模板。引物分别位于待扩增DNA片段的两端，可启动相对方向的DNA合成，其本质是单链DNA片段。当引物与单链模板互补区结合后，在DNA聚合酶的催化下即可进行DNA从5’→3’的9合成反应。PCR包括三个基本过程:①变性（denaturation），即在较高的温度下（93一98）使模板双链DNA解链生成单链，以提供扩增模板。②退火（annealing），即在较低的温度下使引物与DMA模板链互补结合，以备进一步延伸的过程。③延伸（extension），即在适当的温度（一般为70-75℃）下，DNA聚合酶从特异性结合到DNA模板上的引物3’一OH端开始，以待测DN为模板，根据碱基互补配对的原则合成新的DNA分子的过程。以上3个过程组成一个循环周期，每个周期的DNA产物又作为下一个循环周期的模板，如此往复，经过n个循环后，靶DNA的拷贝数理论上可呈2n增长。传统PCR结果判断是通过PCR产物的电泳图结果，对靶基因的有无或表达的多少进行定性或半定量。随着PCR技术的不断发展，根据被检测基因的性质（DNA或RNA）和检测目的的不同，在经典PCR技术的基础上派生出了多种适用于各种场合和需求的PCR方法，如:多重PCR（multipexPCR）、不对称PCR（asymmetricPCR）、降落PCR（touchdownPCR，TDPCR）、巢式引物PCR（nestedprimerPCR）、锚定PCR（anchoredpolymerasechainreaction）、反向PCR（reversePCR）、原位PCR（insituPCR，ISPCR）、逆转录PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR}、着色互补试验或荧光PCR（colorcomple-mentationassayorfluorescentPCR）、定量PCR（