分析方法验证

药品质量标准方法验证及标准规范化1药品的质量标准要素（2000年版中国药典质量标准分析方法验证[1]）药品质量标准（特别是国家药典）既是组织生产、提高质量的手段，又是科学管理和技术监督的组成部分，也是联系科研、生产、供应、使用和检验的技术纽带。因此药品质量标准是我们大家工作成就和能力的综合表现。2000年版药典药品质量标准分析方法验证要素1.验证的目的和时机药品质量标准分析方法验证的目的是：1.分析方法提供的数据必须满足可靠性的要求；2.分析方法应适合于相应的检测要求。何时验证：在起草药品质量标准时，分析方法需经验证；在药物生产方法变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，质量标准分析方法也需进行验证。方法验证过程和结果均应记载在药品标准起草或修订说明中。2.需验证的分析项目鉴别试验，杂质或有关物质定量或限度检查，原料药或制剂中有效成分含量测定，以及制剂中其他成分(如降解产物、防腐剂等)的测定。药品溶出度、释放度等功能检查中，其溶出度等测试方法也应作必要的验证。验证内容有：准确度、精密度(包括重复性、中间精密度和重现性)、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。视具体方法拟订验证的内容。下表中列出的分析项目和相应的验证内容可供参考。检验项目和验证内容项目内容鉴别杂质测定含量测定及溶出量测定定量限度准确度–+–+精密度–––+重复性–+–+中间精密度①–+–+专属性②++++检测限––③+–定量限–+––线性–+–+范围–+–+耐用性++++①已有重现性验证，不需验证中间精密度②如一种方法不够专属，可用其它分析方法予以补充③视具体情况予以验证3.如何验证一．准确度(accuracy)准确度指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，一般以回收率(％)表示。准确度应在规定的范围内建立。回收率应为多少?、RSD应为多少?，现在尚未有明确的数值。1．含量测定方法的准确度原料药可用已知纯度的对照品或样品进行测定；或用本法所得结果与已建立准确度的另一方法测定的结果进行比较。制剂可用含已知量被测物的各组分混合物进行测定。如不能得到制剂的全部组分，可向制剂中加入已知量的被测物进行测定；或与另一个已建立准确度的方法比较结果。如该法已药品质量标准方法验证及标准规范化2建立了精密度、线性和专属性，准确度有时也能推算出来，不必再做。（如原料）2．杂质定量测定的准确度可向原料药或制剂中加人已知量杂质进行测定。如果不能得到杂质或降解产物，可用本法测定结果与另一成熟的方法进行比较，如药典标准方法或经过验证的方法。如不能测得杂质或降解产物的相对响应因子，则可用原料药的响应因子。应明确证明单个杂质和杂质总量相当于主成分的重量比(％)，或是面积比(％)。3．数据要求(需要多少个具体的测量数据)在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价，例如制备3个不同浓度的样品(ICH推荐在标示量的80%、100%和120%的水平上)，各测定3次。应报告已知加入量的回收率(％)，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。二．精密度(precision)精密度指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度。精密度一般用偏差、标准偏差或相对标准偏差表示。含量测定和杂质定量测定应考虑方法的精密度。1．重复性(repeatability)在相同条件下，由一个分析人员测定所得结果的精密度称为重复性。在规定范围内，至少用9次测定结果进行评价，如制备3个不同浓度的样品，各测定3次。或把被测物浓度当作100%，用至少6次的测定结果进行评价。2．中间精密度(intermediateprecision)在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度，称为中间精密度。为考察随机变动因素(不同日期、不同分析人员、不同设备)对精密度的影响，应设计方案进行中间精密度试验。3．重现性(reproducibility)在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度，称为重现性。当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验。如建立药典分析方法时通过协同检验得出重现性结果，协同检验的过程、重现性结果均应记载在起草说明中。4．数据要求均应报告标准偏差、相对标准偏差和可信限。三．专属性(specification)专属性指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。如方法不够专属，应采用多个方法予以补充。1．鉴别反应应能区分可能的共存物质或结构相似的化合物。可通过检验被测样品能得正反应，而不含被测成分的样品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均应呈负反应来证实方法的鉴别能力。如不能证明某一分析方法对某一被测物总是专属的(全面鉴别)，此时可推荐两种或更多种的分析方法配合以达到所需的鉴别水平。2．含量测定和杂质测定色谱法和其他分离方法，应附代表性图谱，以说明专属性。图中应标明各成分的位置，色谱法中的分离度应符合要求。（当采用非专属的方法检测时，应采用能为分析方法提供证据的其它方法以显示其整体的专属性。如用滴定法测定药物含量时，应采用适于检出杂质的方法和含量测定方法一起来说明专属性。）在杂质可获得的情况下，对于含量测定，试样中可加入杂质或辅料，考察测定结果是否受干扰，并可与未加杂质和辅料的试样比较测定结果；对于杂质测定，也可向试样中加入一定量的杂质，考察杂质能否得到分离。在杂质或降解产物不能获得的情况下，可将含有杂质或降解产物的试样进行测定，与另一个经验证了的或药典方法比较结果。用强光照射，高温，高湿，酸、碱水解，或氧化的方法进行加速破坏，以研究降解产物。判断方法：含量测定方法应对比两法的结果，杂质测定药品质量标准方法验证及标准规范化3应对比检出的杂质个数，必要时可采用光二极管阵列检测和质谱检测，进行纯度检查。四．检测限(detectionlimit)检测限指试样中被测物能被检测出的最低量。常用的方法如下：1．直观评价法用已知浓度被测物的样品，试验出能被可靠地检测出的最低浓度或量。用于非仪器分析法(目视法)，也可用于仪器分析法。2．信噪比法用于能显示基线噪音的分析方法，即把已知低浓度试样测量信号与空白样品测量信号进行比较，算出能被可靠地检测出的最低浓度或量。一般以信噪比为3:1或2:1时相应浓度或注入仪器的量来确定检测限。3．数据要求应附测试图谱，说明测试过程（包括各步浓度的响应值）和检测限结果。五．定量限(quantitationlimit)定量限指样品中被测物在规定的实验条件下，以可以接受的准确度和精密度，被定量测定的最低量。杂质和降解产物用定量测定方法研究时，应确定定量限。1．直观评价法分析已知浓度被测物的样品，以可以接受的准确度和精密度定量检测被测物的最低浓度或量来确定。用于非仪器分析和仪器分析法。2．信噪比法一般以信噪比为10:1时相应的浓度或注人仪器的量进行确定。如果有被测物的对照品，可以配制接近定量限的或按规定配制的对照溶液；若没有对照品，推荐用试验药物的稀释液作为对照溶液来进行测定。3．数据要求定量限度和测定定量限度的方法。六．线性(linearity)线性指在设计的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。应在规定的范围内测定线性关系。可用一贮备液经精密稀释，或分别精密称样，制备一系列供试样品的方法进行测定，至少制备5份供试样品。以测得的响应信号作为被测物浓度的函数作图，观察是否呈线性，并用最小二乘法进行线性回归(必要时，响应信号可经数学转换)。数据要求：应列出回归方程、相关系数和线性图。七．范围(range)范围指测试方法以一定的精密度、准确度和线性进行测试的高低限浓度或量的区间。范围应根据分析方法的具体应用和线性、准确度、精密度结果和要求确定。1．原料药和制剂含量测定，范围应为测试浓度的80~120%；2．制剂含量均匀度检查，范围应为测试浓度的70~130%，根据剂型特点，如气雾剂、喷雾剂，范围可适当放宽，溶出度或释放度中的溶出量测定，范围应为限度的±20%；3．如规定限度范围，则应为下限的–20%至上限的+20%；4．杂质测定，研究时，范围应根据初步实测，拟订出规定限度的±20%。5．如果含量测定与杂质检查同时测定，用百分归一化法，则线性范围应为杂质规定限度的–20%至含量限度(或上限)的+20%。八．耐用性(ruggedy)耐用性指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为常规检验提供依据。开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明。1．典型的变动因素有：被测溶液的稳定性，样品提取次数、时间等。2．液相色谱法中典型的变动因素有：流动相的组成和pH值，不同厂牌或不同批号的同类型色谱柱，柱温，流速等。3．气相色谱法变动因素有：不同厂牌或批号的色谱柱、固定相，不同类型的担体、柱温，进样口和检测器温度等。经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效。药品质量标准方法验证及标准规范化4药品质量标准研究（资料7）（药品质量标准研究资料应进行考察的项目）应标示供试样品及对照品的批号、生产单位、提供单位。资料应采用A4纸来整理装订。一．性状应对临床或生产用药品（不是精制品）进行检查，根据此数据来确定质量标准中的性状描述。（注：质量标准中的规定的性状、理化常数应据此制定，不是按资料6中的精品来订出）。[2]性状项下记述药品的外观、臭、味和一般的稳定性情况，溶解度以及物理常数等。“性状”项下记述的外观、臭、味，是一种感观规定，仅须作一般性描述。溶解度：应有不同溶剂的溶解度测定结果（如极易溶解的溶剂、易溶的溶剂、溶解的溶剂、不溶的溶剂等）。也可有在热水或热乙醇、酸性或碱性溶液中的溶解度。制剂应标明处方，根据处方来确定制剂的性状。注意：对药品的晶型、细度或溶液的颜色、相对密度、沸程、熔点（化学药品的熔点一般在3～4℃[3]）、馏程、凝点、比旋度、折光率、粘度、吸收系数……等物理常数需作严格控制时，应在说明分析结果和文献数据或对照品分析结果。二．鉴别对临床或生产用药品进行鉴别检查，应有对照品检验结果或文献数据。必要时应标示有空白试验的结果。一般情况鉴别有官能团的特征反应、TLC、UV、HPLC、IR等。在UV、HPLC、IR的鉴别质量研究中，应提供以下检验图：TLC应有最小检验出量和进行鉴别检验的TLC图谱，图谱应是照片。鉴别样品的用量是根据最低检出量来确定。一般为不少于最低检出量十倍。UV应有样品检验的图谱，尽可标明准确浓度或E值。应有几种不同溶剂的UV图，最好研究不同pH对样品的吸收峰及吸收值的影响HPLC应有溶剂空白、最小检验出量和进行鉴别检验的HPLC图谱，图谱应是图形和峰面积。鉴别样品的用量是根据最低检出量来确定（或按含量测定项下）。一般为不少于最低检出量十倍。IR样品检验的图谱。应对研究压片对样品的晶形是否影响。制剂应补充辅料图谱。三．检查一般包括有效性、纯度及安全性。有效性检查如白喉杭毒素检查项下的“比活性”，纯度检查如“有关物质、熔点及吸收系数等”，安全性如“等”。在检查项下的检查项目有pH值（酸度、碱度及酸碱度）、溶液的澄清度及颜色、装量（片重差异、含量均匀度）、溶出度（崩解时限）、干燥失重（水份）、炽灼残渣、金属盐检查（铜盐、铁盐、重金属及砷盐等）、异常毒性、降压物质、热源（细菌内毒素）、无菌（微生物限度检查）等。检查的项目很多、不同品种的检查项目不同，但对拟收订在质量标准的检查项目一定要进行质量标准研究，应有实验数据、图谱（必需的相片）、文献资料及对照品检查结果。以下简单说明TLC法测定有关物质时应研究的项目。（一）．对起草单位的要求：1．薄层色谱法用于药品的有关物质检查，则需提供建立该法的依据及参考文献。2．如能获得已知杂质，则需进行方法的系统适用性试验。3．对于首次采用的方法，则需提供下述内容：1）展开剂的选择：展开剂即溶剂系统或流动相。点样后的薄层，要用适当的展开剂使药品质量标准方法验证及标准规范化5样品的各组分获得分离。理想的分离，应是得到一组R