植物组织过氧化氢含量的测定

配制100ml、100umol/L的过氧化氢溶液需要多少30%的过氧化氢原液？请写出计算过程。答：首先计算其摩尔浓度：若30%为其质量百分数双氧水30%浓度的试剂（上海国药集团出品），室温时实测密度为：1,122g/L，所以，1L30%含量的双氧水中过氧化氢含量为：1122g/L×1L×30%=337g又H2O2的分子量为34.0146，那么1L30%含量的双氧水中过氧化氢浓度为：337/34.0146=9.908mol/L.100ml×10-3×100umol/L×10-6=9.908mol/L×VV=10-6L=1ul若30%为体积分数100%H2O2密度是1,440g/L,30mlH2O2的质量为1440g/L×30ml×10-3=43.2g，30%含量的双氧水中过氧化氢浓度为：43.2/34.0146/0.1=12.7mol/L.100ml×10-3×100umol/L×10-6=12.7mol/L×VV=7.9×10-7L=0.79ul植物组织中过氧化氢含量测定植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量，利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。【原理】H2O2与硫酸钛（或氯化钛）生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀，可被H２SO4溶解后，在415nm波长下比色测定。在一定范围内，其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。【仪器和用具】研钵；移液管0.2ml×2支，5ml×1支；容量瓶10ml×7个，离心管5ml×8支；离心机；分光光度计。【试剂】100μmol/LH2O2丙酮试剂：取30%分析纯H2O257μl，溶于100ml，再稀释100倍；2mol/L硫酸；5%（W/V）硫酸钛；丙酮；浓氨水。【方法】1.制作标准曲线：取10ml离心管7支，顺序编号，并按表加入试剂。测定H2O2浓度标准曲线配置表试剂（ml）离心管号1234567100μmol/LH2O200.10.20.40.60.81.04℃下预冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸钛0.10.10.10.10.10.10.1浓氨水0.20.20.20.20.20.20.23000r/min离心10min，弃去上清夜，留沉淀2mol硫酸5.05.05.05.05.05.05.0待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2g，按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按表1加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后5000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。3.结果计算：植物组织中H2O2含量(μmol/gFw)=CVtFWV1式中C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度（μmol）；Vt—样品提取液总体积（ml）；V1—测定时用样品提取液体积（ml）；FW—植物组织鲜重（g）。4、实验结果:1234567H2O2浓度00.10.20.40.60.81.0吸光度A00.0490.1260.3150.4250.6250.778得出标准曲线如下图：过氧化氢与吸光值关系的标准曲线y=0.7643xR2=0.994200.10.20.30.40.50.60.70.80.900.20.40.60.811.2100umol/L过氧化氢量体积（ml）吸光值测定所得样品的吸光度为0.188，带入得0.2459，考虑到称取鲜重2.116g代入公式含量为H2O2=0.116μmol/gFw。注意事项1、离心机离心时应该先配平。2、加试剂的顺序一定不可以错。3、每次加完一种试剂后都要充分摇匀。4、注意所用H2O2的浓度。