生物技术大实验指导

河北联合大学生命科学学院分子生物学技术大实验操作指导手册生物工程系二零一二年五月2目录实验一PCR技术体外扩增DNA片段……………….………………….3实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA……………….………….………..4实验三DNA片段的凝胶回收………………………………..……..…5实验四DNA的重组技术……………………….……………………….7实验五转化及重组子的筛选…………………………………..….….9实验六质粒DNA的提取………………………………………….…..11实验七克隆子的鉴定…………………………………..……….…..13实验八SDS－PAGE测蛋白质的分子量……….………………….……15实验九WESTERNBLOT检测蛋白……………….………….…….……18实验十、凝胶图谱分析……………………………………….…….…183实验一PCR技术体外扩增DNA片段实验目的通过本实验学习PCR反应的基本原理和实验技术。实验原理多聚酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段的两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，依赖于DNA聚合酶的酶促合成反应。经变性、退火和延伸若干循环后，DNA扩增2n倍。1．变性：加热使模板DNA在高温下（94℃）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。2．退火：使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补。3．延伸：在DNA聚合酶的作用下，以单链DNA为模板，利用四种脱氧核苷酸，按5'→3'的方向复制出与模板互补的DNA链。上述三步为一个循环，每经过一个循环，样品中的DNA量应增加一倍，新形成的链又可作为新一轮循环的模板。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物和耐热Taq聚合酶。仪器PCR热循环仪，琼脂糖凝胶电泳系统，各种规格的移液器，制冰机等试剂：特定大小产物PCR反应试剂盒（500bp）1.DNA模板：pBS5001-2ng/l2.TaqDNA聚合酶2.5UdNTP混和物2.5mMeach10×Taqbuffer(MgCl215mM)3.引物1、引物2(10M)4.ddH2O5.琼脂糖6.DNA相对分子量标准物（DNAMarker）实验步骤：1.实验体系的建立：根据以下的反应体系向管中加入各种成分。PCR反应体系(各种成分单独加入)以下举例为常规PCR反应系统，仅供参考。实际反应条件因模板、引物等的结构不同而各异，需根据模板、目的片段的大小、碱基序列和引物长短等具体情况，设定最佳反应条件。50l反应体系如下(可根据比例放大或缩小反应体系)：4Template（pBS500）4lPrimer1（10M）2lPrimer2（10M）2l10×TaqBuffer5ldNTPMixture(2.5mM)4lTaq(2.5U/l)1lddH2O补至50l2.94℃2min94℃30sec55℃30sec35cycles72℃30sec72℃5min3.结果检测：反应结束后取5l反应产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测结果。实验二琼脂糖凝胶电泳检测DNA实验目的通过本实验学习用琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。实验原理琼脂糖凝胶电泳分离DNA的能力是通过电荷效应和分子筛效应来完成的。DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中从负极向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速率取决于DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速率与相对分子量的对数值成反比关系。在相对分子量相同的情况下，DNA分子的迁移速率依次为：超螺旋状DNA带切口环状DNA线形DNA。凝胶中琼脂糖的百分含量由被分离的DNA大小决定（参照下表）。电泳后的凝胶经溴化乙锭荧光染料染色，根据与DNA相对分子量标准物的比较，即可确定DNA片段的大小。琼脂糖凝胶浓度%线性DNA的有效分离范围Kb0.35-600.61-200.70.8-100.90.5-71.20.4-61.50.2-42.00.1-3仪器琼脂糖凝胶电泳系统，紫外透射箱或凝聚图像分析仪5试剂1.0.5×TBE电泳缓冲液2.6×上样缓冲液3.琼脂糖4.DNA相对分子量标准物（DNAMarker）5.溴化乙锭（EB）用水配制成10mg/ml的溶液，使用浓度为0.5g/ml。注意：溴化乙锭是一种强诱变剂并有中度毒性。使用含此染料的溶液时必须带手套。使用后的溶液和物品应专门处理，不要随意丢弃。实验步骤（一）制备1%的琼脂糖凝胶称取1g琼脂糖，放入锥形瓶中，加入100ml的0.5×TBE缓冲液，在微波炉中加热。完全融化后，冷却到60℃左右，加入5-10l的10mg/ml溴化乙锭溶液后摇匀。（二）胶板的制备1.用隔板将胶板的两端边缘封闭好。2.将胶板放在水平处，放好样品梳子(注意梳子底部距离胶板1-2mm)。3.将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶缓慢倒入胶板中，注意不要产生气泡。胶厚度在8mm之间。4.待胶凝固后，取出梳子，取下隔板，放入电泳槽内（注意：梳子的方向靠近负极）。5.向电泳槽中加入0.5×TBE缓冲液，缓冲液要浸没凝胶。（三）加样1.在样品中加入适量的6×上样缓冲液，使缓冲液的终浓度为1×。2.用微量移液器将已加入缓冲液的样品加入上样孔中。记录加样的顺序和加样量。（注意：加样的过程中不要让样品溢出上样孔）（四）电泳1.接通电泳槽与电泳仪的电源（注意DNA片段是从负极向正极移动）。DNA的迁移速度与电压成正比。最高电压不超过5V/cm。2.当溴酚蓝染料移动到凝胶的1/2—2/3处时，停止电泳。（五）观察实验结果在紫外灯（360nm或254nm）下观察染色后的凝胶，DNA处显出橘红色的荧光条带。实验三DNA片段的凝胶回收实验目的从琼脂糖凝胶中回收目的DNA条带。目的DNA片段的回收技术是重组DNA中的关键技术，回收是指从电泳介质中纯化出目的片段。目前待回收的片段主要有酶切片段和各种PCR片段。回收的介质主要有琼脂糖和PAGE；回收的方法主要有树脂回收、离心柱回收、玻璃奶回收和透析袋大量回收等，下面介绍离心柱回收技术。实验原理采用可以高效、专一结合DNA的硅基质材料和独特的缓冲液系统，从TAE或TBE琼脂糖凝胶上回收DNA片段，同时除去蛋白质、其它有机化合物、无机盐离子及寡核苷酸引物等杂质。可回收100bp－10kb大小的片段。6本方法具有操作简单的特点，特别适合于PCR片段、酶切片段等的回收。仪器：琼脂糖凝胶电泳系统，紫外透射箱，电子天平，高速冷冻离心机试剂：1.0.5×TBE电泳缓冲液2.6×上样缓冲液3.琼脂糖4.DNA相对分子量标准物（DNAMarker）5.溴化乙锭（EB）6.无水乙醇7.离心柱型普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒注意事项：1.电泳时最好使用新的电泳缓冲液，以免影响电泳和回收效果。2.如下一步实验要求较高，则应尽量使用TAE电泳缓冲液。3.切胶时，紫外照射时间应尽量短，以免对DNA造成损伤。4.如果回收率较低，可在胶充分溶解后检测pH值，如pH值大于7.5,可向含有DNA的胶溶液中加10—30µl3M醋酸钠（pH5.2）将pH值调到5－7之间。5.回收100bp及10kb的DNA片段时，应加大溶胶液的体积，延长吸附和洗脱的时间。实验步骤1.紫外灯下将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。2.向胶块中加入3倍体积溶胶液PN（如果凝胶重为0.1g，其体积可视为100µl，则加入300µl溶胶液），50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解(若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块)。(胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱)。3.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB1或CB2中（依所购买的试剂盒种类而定）（吸附柱放入收集管中），13,000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放入收集管中。4.向吸附柱中加入700μl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），13,000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新放入收集管中。5.向吸附柱中加入500μl漂洗液PW，13,000rpm离心30秒，倒掉废液。将离心吸附柱CB1或CB2放回收集管中，13,000rpm离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温或50℃温箱数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。7如果漂洗液有残留会影响回收效率和DNA质量。6．将吸附柱放到一个干净离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量65－70℃水浴预热的洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。13,000rpm离心1分钟收集DNA溶液。7．为了提高DNA的回收量，可将离心得到的溶液重新加回离心吸附柱中，重复步骤6。CB1柱的洗脱体积不应少于20μl，CB2柱的洗脱体积不应小于30μl过小影响回收效率。洗脱液的pH对于洗脱效率有很大影响。若用水做洗脱液应保证其pH值在7.0-8.5范围内，pH值低于7.0会降低洗脱效率；且DNA产物应保存在-20℃，以防DNA降解。也可用TEbuffer(10mMTris·Cl,1mMEDTA,pH8.0)作为洗脱缓冲液，但EDTA会影响后续的酶反应等实验。实验四DNA的重组技术实验目的通过本实验学习DNA重组的原理和技术。实验原理DNA重组，即外源DNA分子与载体分子的连接，实际上是指在双链DNA的5'磷酸和相邻的3'羟基之间形成新的共价键。进行DNA连接的方法有很多，主要有粘端连接法和平端连接法。后者还包括平接法和接头法，以及平-粘连接法。选择这些方法的依据主要是外源DNA片段和质粒载体的末端以及它们限制性内切酶酶切位点的性质（参见下表）。外源DNA片段末端克隆的要求说明平端高浓度的DNA和连接酶1.非重组体克隆的背景可能很高2.载体和外源DNA接合处的限制性酶切位点消失3.重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝不同的突出端用两种限制酶消化后，需纯化1.载体和外源DNA接合处的限制性酶切位点可保留质粒载体以尽量提高连接效率2.非重组体克隆的背景较低3.外源DNA以一个方向插到重组质粒中相同的突出端线形质粒DNA常用磷酸酶处理1.载体和外源DNA接合处的限制性酶切位点可保留2.外源DNA以两个方向插入3.重组质粒会带有外源DNA的串联拷贝DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。这两种DNA连接酶都具有将相同粘性末端的DNA分子连接在一起的功能。而T4噬菌体DNA连接酶还具有将两个平头末端的双链DNA分子连接在一起的活性，但后者的连接效率往往低于前者的连接效率。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为三步：首先，T4噬菌体DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5'磷酸基和3'羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后，产生一个新的磷酸二酯键，封住切口。8许多耐热DNA聚合酶，如TaqDNA聚合酶，TaqDNA聚合酶等扩增的PCR产物在3'-末端后都带有一个突出的碱基A，而T载体的3'-末端后都带有一个突出的碱基T，因此，T载体是适用于克隆带有3'-末端A突出的PCR产物的克隆载体。而且T载体具有β半乳糖苷酶阅读框，可通过蓝白斑筛选阳性克隆。仪器恒温水浴试剂:pGM-T克隆试剂盒：20次×2实验步骤:（以下操作在无菌环境下进行）1将载体在冰上融化（尽可能避免反复冻融载体，在初次使用时最好分装成小份，每次使用时取出一份），短暂离心装有载体的离心管，以免液体挂在管壁上。2按照下表的内容在无菌的离心管中加入各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1：3—1：8，请根据凝胶电泳或紫外分光光度计检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算其摩尔比。加入过多的片