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•1.打开一张图片•在默认的intensity格式中，是图片灰度，越黑数值越小，越白数值越大。而实际上我们测量的染色强度是光密度，染色越深，光密度值越大。•如果不进行光密度单位的转换，测量的数值将完全是错误的。转换光密度单位的方法如下:•点击:measure--carliberation--intensity，调出intensity校正窗口。•然后在窗口中点new按纽，再点一下下面的stdopticaldensity选项，这时可以看到窗口中的直线变成了反向的曲线。•然后还要点一下最上面的system按纽。•最后点close关闭窗口。•这样就把程序系统的灰度单位转换成了光密度单位。•关于光密度较正的详细内容请参见第十帖及第十一帖。•校正光密度单位的操作要在打开第一张图片后立即进行。将光密度单位设定为system之后就不必再对后面的每一张照片都进行光密度校正了。2.点击measure---count/size图13.在窗口中选中manual,再点击selectcolor,弹出颜色选择窗口segmentation图24.点一下吸管图标，在目标区域点一下，就可以选中该点的颜色，当然一下是不可能完全选中所需要指定的全部区域，可以在未选中的地方接着再点，这样多次选取，直到把想选中的区域全部选中为止。5图3中被标上红色的区域被定义为一个class,其中每一个独立的小区块被定义为这个class中的一个object。以此图为例，图中深蓝色的部分是细胞核，因此所有的细胞核都被选中成一个class，其中每一个细胞核就是一个object。用红框圈起来的四个工具按纽分别是:吸管、撒消上一步操作、橡皮擦、全部清除。下在的小方框里则是吸管位置的选取颜色。图36选取完AOI后，点击close回到count/size窗口，下一步就可以对选中的object进行测量操作了。如图4所示。•点击count/size窗口中的measure菜单，点selectmeasure，这是选择要进行何种测量操作，在弹出的测量选择窗口左侧列出了各种可用的测量选项，最常用的测量有:•area面积•density(mean)平均光密度•diameter直径•IOD(integratedopticaldensity)累积光密度•在相应的项目上点一下，该测量项目就被选到中间的窗口中了，同时关于该测量的详细说明会显示在最右边。如果想取消某个已选中的测量项目，则在左边窗口中该项目上再点击一下就可以了。图47选好了待测量的区域，也指定了测量项目，就可以进行测量统计了，点击一下测量选择窗口的OK纽，关闭这个窗口，就回到了count/size窗口，再点击一下count按纽，就可以看到程序在进行测量，稍等几秒钟即可读取测量数据.如图5•分别点击count/size窗口中view菜单中的measurementdata和statistics，就分别弹出这两个数据窗口。前者是这个calss中每一个object的测量数据，后者是这些测量数据的统计参数，如总数、平均值、累加、标准差等。本例中得到的就是每个细胞核的面积、平均光密度值、直径、累积光密度值。统计数据则可得到这张图片中所有细胞核的平均面积、平均光密度值，平均直径、累积光密度值，当然还有细胞核的数目，就是所有object的数目。图59测量数据转入EXCEL处理起来最方便。只要在数据菜单中点file-DDEtoEXCEL。数据就传到EXCEL的sheet1里去了。如图6.•在这个示例图片的统计数据中samples为图中所有细胞核的个数。•第一列为area,其中的Mean值为各个核的平均面积，后面就是平均灰度、平均直径，这些是有意义的测量统计数值。但IOD却是SUM值更有意义。图6二、irregular工具这是一个用来描绘不规则孤立对象边界的工具。图中一个个棕黄色形状是免疫组化染色的贴壁培养细胞，为了计算每个细胞的面积及蛋白表达，首先就是要选取每个细胞的边界线。这就可以用到irregular工具了。在工具栏上点一下那个不规则园形的按纽，就调出了irregular工具条。图7•图8：这个工具的标题叫Magicwand，就是photoshop中的魔棒呀。将鼠标移至图中一个细胞的中间，光标就变成魔棒了，在一个位置左键点一下，就选中了这个位置及其周围灰度相似的区域。这里相似的定量范围由Range的值来决定。较大的值为较大的灰度范围，点一下能选中一大片区域。较小的range值则为较小的灰度范围。在一个区域上多点几下，就能选中这个区域的整个边界了。最后点一下右键，就确定了一个不规则形状的选定区域。•点一下左边的问号，就能看到相应的使用说明。smooth值是用来平滑区域边界的。一般不需要平滑，因此默认值为零。图8选择多个区域（图9）•选中一个区域后如果还要在同一张图片上再选另一个区域，不能直接点选，要先点击一下工具栏上的MultipleAOI按纽，再点击add，接下去就可以到另一个选择区域点选。•选好一个新的区域后再回去点MultipleAOI--add确认，再继续下一个，直到选取完所有的AOI。最后在图片上任一处点一下右键结束选择操作。结束后如果又想再增加选择区域，只要再点一下newAOI按纽，就可以调出工具条继续增加选择区域。图9•这个irregular工具还有另一个操作方式，在问号旁边有个trace按纽，点一下它，工具条就变成另一个样子了。•这种操作方式是沿着孤立图像的边缘寻迹，从而画出一个沿着孤立形状边缘围成的一个AOI。•第一种是手画法。确认工具条右边的Auto选项没有打勾，将光标移至目标图形处按住左键拖出一个闭合图形，点右键结束。用鼠标画当然是不会准确的。实在没别的招了才会出此下策。•第二种方法是自动寻迹。图10所示•把那个Auto给选上，speed值给减到1(慢速看得清楚)，在目标图形的边缘处左键点一下鼠标，然后沿着边缘稍移动一下鼠标后再点击一下左键，这是给程序指明一个寻迹的方向，马上就能看到光标自动沿着边界走起来了，一直会走到起点处才会停止。这样就自动围成了一个闭合区域，点一下右键就确认了这个AOI。重复选取多个AOI的方法与楼上一样。•如果目标图形边界清晰，那么这个工具是非常管用的。可惜的是在许多情况下边界是模糊不清的，光标走到此处时会乱走一气。这时就要及时先点一下鼠标使光标暂停下来，然后在期望的方向延长再点一下左键，给程序指明一下前进的方向，如此多次，直到光标回到起点为止。最后点一下右键围成一个闭合的AOI。围好的AOI边界是绿色框。图10测量每个区域的几何尺寸及光密度图11•点开count/size窗口，点菜单EDIT---convertAOItoObjects.这样就把刚才选中的一个个AOI变成了要测量的object了，那些小区域的颜色也由AOI绿色外框线变成了object的标记了。•object的标记类型是可以自己设定的。在count/size窗口右边有一个option按纽，点开它就能设定object标记的外观了。在option窗口中，outlinestyle可以选outline(轮廓线)或filled(填充class颜色)。labelstyle可以选择为object序号或测量值。再下面是label的文字颜色。•右上角还有一个class的颜色选择按纽。图11•下一步是点measure菜单下的selectmeasurements。选上要测量的项目。•注意，选完后要点击这个菜单中的measure按纽(而不是count/size窗口中的count按纽)。然后是OK按纽关闭measure窗口，点开view菜单下的measurementdate和statistics数据窗口。几个object的测量数据就已经在里面了。•如果你还想继续增加objcet，可以直接用irregular工具画AOI，然后点convertAOItoobject。这期间把数据窗口留着不关闭，可以看到新增的object测量数据会立即被更新图12segmentation工具1打开图片并调出count/size窗口图13