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第三节菌种保藏与复壮一、菌种保藏菌种保藏的重要意义：菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产，如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。菌种是国家的重要资源，1980年我国成立了中国微生物菌种保藏委员会。第四章菌种保藏的原理与方法一菌种保藏的原理：菌种保藏主要是根据菌种的生理、生化特性，人工创造条件使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。保藏时，一般利用菌种的休眠体（孢子、芽孢等），创造最有利于休眠状态的环境条件，如低温、干燥、隔绝空气或氧气、缺乏营养物质等，以降低菌种的代谢活动，减少菌种变异，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力，达到长期保存的目的。一个好的菌种保藏方法，应能保持原菌种的优良特性和较高的存活率，同时也应考虑到方法本身的经济、简便。二、工业微生物菌种保藏技术：1.斜面低温保藏法2．矿物油中浸没保藏法3．固体曲保藏法4．砂土管保藏法5.普通冷冻保藏6．超低温冷冻保藏法7.冷冻干燥法8.液氮冷冻保藏法9.寄主保藏1.斜面低温保藏本方法是利用低温降低菌种的新陈代谢，使菌种的特性在短时期内保持不变。将新鲜琼脂培养基斜面上长好的菌体或孢子，置于4℃冰箱中保存。一般的菌种均可用此方法保存1～3个月。保存期间要注意冰箱的温度，不可波动太大，不能在0℃以下保存，否则培养基会结冰脱水，造成菌种性能衰退或死亡。此法最为简单和经济，且不要求任何特殊的设备。可用于实验室中若干菌种的保藏。但此方法易发生培养基干枯、菌体自溶、基因突变因此要求在基本培养基上传代为好，目的是能淘汰突变株；同时转接菌量应保持较低水平。斜面培养物应在密闭容器中于5℃保藏，以防止培养基脱水并能降低代谢活性。此方法是一种短期、过渡的保藏方法此方法，一般不适宜作工业生产菌种的长期保藏，一般保存时间为3~6个月。如放线菌于4~6℃保存，每3个月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6个月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6个月移接一次。将琼脂斜面或液体培养物浸入矿物油中于室温或4℃冰箱保存，此方法简便有效。保存期约1年。可用于丝状真菌、酵母、细菌和放线菌的保藏。特别对难于冷冻干燥的丝状真菌和难以在固体培养基上形成孢子的担子菌等的保藏更为有效。2.矿物油中浸没保藏浸没保藏的操作要点是首先让待保藏菌种在适宜的培养基上生长，然后注入经170℃下灭菌1-2h的矿物油(液体石蜡可采用蒸汽灭菌，灭菌后的石蜡在40℃烘箱中烘干备用)。矿物油的用量以高出培养物1cm为宜。以液体石蜡作为保藏方法时，应对需保藏的菌株预先作试验。因为某些菌株在液体石蜡下生长还十分明显，有些菌株如某些假丝酵母还会同化液体石蜡，也有的对液体石蜡保藏敏感。所有这些菌株都不能用液体石蜡保藏。为了预防不测，一般保藏株2～3年也应做一次存活试验。3.固体曲保藏法这是根据我国传统制曲原理加以改进的一种方法，适用于产孢子的真菌。该法采用麸皮、大米、小米或麦粒等天然农产品为产孢子培养基，使菌种产生大量的休眠体（孢子）后加以保存。该法的要点是控制适当的水分。4砂土管保藏法本方法是用人工方法模拟自然环境使菌种得以栖息。适用于产孢子的放线菌、霉菌以及产芽孢的细菌。砂土是砂和土的混合物，砂和土的比例一般为3：2或1：1，将黄砂和泥土分别洗净，过筛，一般沙用80目过筛，土用80～100目过筛。按比例混合后，装人小试管内，装料高度约为1cm左右，121℃间歇灭菌2～3次，灭菌后烘干，并作无菌检查后备用。将要保存的菌种斜面孢子刮下，直接与砂土混合；或用无菌水洗下孢子，制成悬浮液，再与砂土混合。混合后的砂土管放在盛有五氧化二磷或无水氯化钙的干燥器中，用真空泵抽气干燥后，放在干燥低温环境下保存。此法保存期可达1年以上。5.普通冷冻保藏由于该法的保藏温度为－20℃，为了避免微生物受损伤致死，需要甘油作为保护剂。甘油的最终浓度为25%。具体操作如下：①配制浓度为50％的甘油溶液，121℃灭菌后备用；②制备菌悬液，一般菌悬液的浓度为108～1010个／mL；③将菌悬液和甘油溶液以等体积混合均匀后，置－20℃保藏。或者，将菌种培养在小的试管或培养瓶斜面上，待生长适度后，将试管或瓶口用橡胶塞严格封好，同上置于冰箱中保存。用此方法可以维持若干微生物的活力1—2年。应注意的是经过一次解冻的菌株培养物不宜再用来保藏。保藏过程中应注意控制保藏温度，培养瓶或试管应严格密封。这一方法虽简便易行，但不适宜多数微生物的长期保藏。6.超低温冷冻保藏要求长期保藏的微生物菌种，一般都要求在-60～-80℃以下进行保藏。在超低温冷藏柜中保藏菌种的一般方法是：1．离心收获对数生长中期至后期的微生物细胞2．用新鲜培养基重新悬浮所收获的细胞；3．加入等体积的20％甘油或10％二甲亚砜；4．混匀后分装入冷冻指管或安瓿中，于-70℃超低温冰箱中保藏。如果待保藏菌种生长在斜面上，则可用含10％甘油的新配制液体培养基洗涤收获。超低温冰箱的冷冻速度一般控制在1-2℃／min。若干细菌和真菌菌种可通过此保藏方法保藏5年而活力不受影响。7．冷冻干燥法其基本原理是在较低的温度下（－18℃），快速地将细胞冻结，并且保持细胞完整，然后在真空中使水分升华。这样菌种的生长和代谢活动处于极低水平，不易发生变异或死亡，因而能长期保存，一般为5～10年。此法适用于各种微生物。具体的做法是先将微生物制成悬浮液，与保护剂（一般为蔗糖、脱脂牛奶或血清等）混合，放在安瓿管内，用低温酒精或干冰（－15℃以下）使之速冻，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，低温保存备用。经冻干后的菌株无需进行冷冻保藏，便于运输培养物的冻干过程抽真空最终菌株浓度一般要求在106CFU／mlCFU代表“colonyformingunits”。CFU/mL指的是每毫升样品中含有的细菌群落总数。冻干菌种的保藏与再生1．保藏：冷冻干燥后的培养物在低于5℃下保藏。较低的保藏温度(-20～-70℃)对于培养物的长期稳定更好。2．复苏：在安瓿中加入0.5～1ml营养液体培养基，慢慢旋转安瓿，使冻干菌种复水。然后将此转接到一含有再生培养基的无菌试管中，或直接接种琼脂斜面或涂布平板。在指管中冻干的菌种通常为絮粉状，可以将此直接振落入盛有l～2ml液体培养基的试管中，轻轻振荡5～l0min，然后用此悬液接种适宜的再生培养基。8.液氮冷冻保藏法液氮超低温保藏法是近几年才发展起来的，此法国外已较普遍采用，是适用范围最广的微生物保藏法。尤其是一些不产孢子的菌丝体，用其他保藏方法不理想，可用液氮保藏法，其保存期最长。我国国内目前已有很多单位采用液氮法保存菌种。原理用液氮能长期保存菌种。这是因为液氮的温度可达－196℃，远远低于其新陈代谢作用停止的温度（－130℃），所以此时菌种的代谢活动已基本停止，化学作用亦随之消失。9.寄主保藏适用于一些难于用常规方法保藏的动植物病原菌和病毒。菌种保藏的注意事项：1．菌种在保藏前所处的状态一般以稍低于生长最适温度培养至孢子成熟的菌种进行保存，效果较好。2．菌种保藏所用的基质碳源、砂土、保护剂3．操作过程对细胞结构的损害冻结速度基因工程菌的保藏由载体质粒等携带的外源DNA片段通常是遗传不稳定的、且很易丢失其外源质粒复制子。质粒基因通常为宿主细胞生长非必需。一般情况下当细胞丢失这些质粒时，生长速度会加快当培养基中加入抗生素时，抗生素提供了一有利于携带质粒的细胞群体的极有用的生长选择压力。而且在运用基因工程菌进行发酵时，抗生素的加入可帮助维持质粒复制与染色体复制的协调。建议基因工程菌应保藏在含低浓度选择剂的培养基中例如，质粒pBR322。它除了能将外源DNA输入E．coli细胞外，还赋予E．coli细胞Ampr和Tetr。如果在培养基中加入Amp(氨苄青霉素)和Tet(四环素)，则培养时可选择出含pBR322质粒的细胞。三.微生物活力和稳定性测定所有保藏菌种的方法都必须是长期可靠地保持菌种的优良性状不变。在保藏时定期检测菌种活力，以确定保藏培养物的保藏期限和保藏方法的可靠性，以及确定在实际保藏过程中出现的细胞死亡程度和遗传稳定性。对工业微生物生产菌种来说，建议保藏菌种的形态学和生化特征(如代谢产物的产生、酶活力、遗传特征及生化指标)应在保藏后加以检测和确定。成功的菌种长期保藏方法之有价值的指标包括在保藏6个月、1年或更长时间后存活百分率(或存活单位)。细胞群体的形态学特征或一些特别的生化特征应在菌种保藏前后保持同一性，以及实验室中、中试车间中和生产发酵中产品滴度的稳定性，后者极为重要。加速保藏试验可用于预测保藏过程中保藏培养物的稳定性。在一给定温度下通过对高温下短期活力丧失程度检测，可以用来预测嗜酸乳杆菌的稳定性。四.菌种的复壮生产上使用的菌种，在使用和保藏过程中，经常会逐渐向不利于生产的方向发生变化，这种变化称之为菌种衰退一般衰退菌种的复壮措施如下：纯种分离淘汰衰退的个体选择合适的培养条件五.国内外主要菌种保藏机构介绍（1）ATCCAmericanTypeCultureCollection。Rockvil1．Maryland.U.S.A.美国标准菌种收藏所，美国，马里兰州，罗克维尔市.（2）CSHColdSpringHarborLaboratory.U.S.A.冷泉港研究室，美国.（3）IAMInstituteofAppliedMicrobiology.UniversityofTokyo，Japan.日本东京大学应用微生物研究所，日本东京.（4）IFOInstituteforFermentation.Osaka，Japan.发酵研究所，日本大阪.（5）KCCKakenChemicalCompanyLtd．Tokyo，Japan.科研化学有限公司，日本东京.（6）NCTCNationalCollectionofTypeCulture.London，UnitedKingdom.国立标准菌种收藏所，英国伦敦.（7）NIHNationalInstitutesofHealth.Bethesda，Maryland，U.S.A.国立卫生研究所，美国，马里兰州，贝塞斯达.（8）NRRLNorthernUtilizationResearchandDevelopmentDivision，U.S.DepartmentofArgiculture.Peoria，U.S.A.美国农业部、北方开发利用研究部，美国皮奥里亚市.