动物组织切片的制作与染色

1水产动物组织切片的制作与染色2一、实验目的学习石蜡切片法了解组织染色原理掌握各组织器官的基本结构3组织切片标本—载玻片——盖玻片组织——二、实验原理4二、实验原理取材固定脱水透明浸蜡包埋切片染色封片51.取材根据不同的实验目的，选择相应的材料，材料要求新鲜、准确、完整，材料要避免挤压、挫伤、干枯。①种类：②部位：肝③年龄或发育阶段④是观察横切面还是纵切面？取材原则：动作------快，轻，用力均匀体积合适：0.3×0.3×0.3cm刀要锋利及时固定:编号,注明采集时间、地点、名称、组织部位62.固定取材后应及时固定，编号，注明采集时间、地点、名称、组织部位。目的---保持原来的结构固定液：波恩氏液固定时间：48h左右固定后的处理：将固定液换成70%乙醇作短期保存7单一固定液复合固定液—长处突出，短处抵消（Bouin’s）8固定组织时应注意：①保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处理。②固定液必须有足够的量，一般大于组织20倍以上。③组织块不易过大过厚，厚度必须控制在0.3cm以内。④冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除固定液造成的人为假象。⑤抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并排除材料内气泡的干扰。9水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后，才能让透明剂进入。现采用的脱水剂一般是乙醇或丙酮。它既能与水相混合，又能与透明剂相混。脱水的过程：70%→80%→90%（各1h）→95%→95%→100%→100%（各20min）脱水的时间，可根据组织的类型，大小而定。保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全脱净，但不能过度脱水（过久使组织变脆,收缩）3.脱水104.透明二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。替代品：水杨酸甲酯（30min），氯仿等。11将完成透明步骤的组织块浸入透明剂与石蜡混合液中，不断提高石蜡的比例，直至用石蜡完全置换了组织块中的透明剂，使石蜡浸入组织而起支持作用，便于今后的包理与切片（1h）。浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱（60℃）中进行，以利石蜡浸入组织内。5.浸蜡12将液态石蜡缓缓倒入金属模具中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入金属模具，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕（约15min）。6.包埋137.切片包埋好的蜡块用刀片修成规整的方形或长方形，附于小木块上通常切片厚度为5～6um切出一片接一片的蜡带，用毛笔轻托轻放在纸上。14贴片与烤片用粘附剂将展平的蜡片牢附于载玻片上，以免在以后操作中使材料脱落。在载玻片上涂抹粘片剂，再滴蒸馏水，放上蜡片铺展，最后用滤纸吸除多余水分，将载玻片放入45℃温箱中干燥。158.染色（H.E）碱性染料，使细胞核等呈紫蓝色——嗜碱性酸性染料，使一般胞质和胶原纤维呈粉红色——嗜酸性苏木精（hematoxylin）伊红（eosin）16染色液配制179.封片染色后的切片尚不能在显微镜下观察，需经梯度酒精脱水，在95％及纯酒精中的时间可适当加长以保证脱水彻底；如染液为酒精配制，则应缩短在酒精中的时间，以免脱色。二甲苯透明后，滴加适量（1～2滴）中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡。18三、实验主要仪器切片机烤片机摊片机19四、实验试剂Bouin氏液：饱和苦味酸75ml,甲醛25ml，冰乙酸5ml。Ehrilich氏酸性苏木素液：苏木素2g，纯酒精100ml，钾明矾15g，蒸馏水100ml，甘油100ml，冰醋酸10ml1%伊红染液：中性曙红0.5~1g，蒸馏水100ml1%盐酸-酒精分化液：浓盐酸1ml，70%酒精99ml。梯度酒精：70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、无水乙醇。二甲苯石蜡中性树胶20五、实验步骤（1）取材21取材固定（24-36h）→70%乙醇（1h）→80%乙醇（1h）→90%乙醇（1h）→95%乙醇（20min*2）→100%乙醇（20min*2）水杨酸甲酯（约30min）→1/2石蜡+1/2二甲苯（20min）→蜡杯（20min*2）→包埋→切片→贴片→烤片（2）脱水、透明、浸蜡、包埋、切片22（3）H.E.染色流程二甲苯脱蜡（1）（10min）→二甲苯脱蜡(2)（5min）→1/2100%乙醇+1/2二甲苯（1）（3min）→100%乙醇（2min）→95%乙醇（2min）→80%乙醇（2min）→70%乙醇（2min）→蒸馏水洗（3min）吸水→苏木精染色（14min）→自来水洗（10min）→分化液分化（3s）→自来水洗（3～5min）→伊红染色（1.5min）→70%乙醇（2min）→80%乙醇（2min）90%乙醇（2min）→95%乙醇(1)(2)（2min）→100%乙醇(1)(2)（2min）→二甲苯(1)(2)（3min）→中性树胶封片→显微镜观察23六、结果分析-切片的观察要求：各小组将固定的组织切片图拍照，并标出图中的结构名称。各组提交一张认为制作较好的玻片。