生化试验观察血清中谷丙转氨酶的活力变化

实验六观察血清中谷丙转氨酶的活力变化Experiment6ObservingEnzymeActivityChangesofAlanineAminotransferaseinSample一、目的要求1、了解血清谷丙转氨酶活力变化的意义2、掌握血清谷丙转氨酶活力的测定方法二、相关知识点1.转氨作用transamination2.氨基转移酶转氨酶（aminotransferase，transaminase）催化氨基酸与酮酸之间氨基转移的一类酶谷丙转氨酶glutamic-pyruvictransminaseGPT又称丙氨酸转氨酶alanineaminotransferaseALT谷草转氨酶glutamicoxaloacetictransaminaseGOT又称天冬氨酸转氨酶aspartatetransaminase,AST3.转氨作用的机制：4．转氨作用的意义正常时转氨酶主要分布在细胞内，血清中酶活力很低GOT以心脏细胞中活力最大，其次为肝脏细胞GPT则以肝脏细胞中活力最大正常组织异常组织心脏肝脏心脏肝脏细胞中酶活力GOT高GOT/GPT高细胞破损酶溢出血清中酶活力GOT低GOT/GPT低GOT升高GOT/GPT升高5.谷丙转氨酶的临床意义如果GPT血清值超过正常上限2－3倍，并持续两周以上，表明有肝胆疾病存在的可能。ALT的正常上限是40单位，2.5倍为100单位，20倍为800单位。三、实验原理丙酮酸二硝基苯腙红棕色2,4-二硝基苯肼COOHCH2CH2COCOOHCOOHCH2CH2CHNH2COOHCH3CHNH2COOHGPTCH3COCOOHCH3CNNHNO2NO2H2OOHH2NHNNO2NO2COOHSUBSTRATEPyruvatedinitratephenylhydrazone2,4-dinitratephenylhydrazinealanineα-ketoglutarateRedbrownpyruvicacidpyrivicacidglutamicacidSALT单位的定义是：1ml血清在37℃与底物作用30min，每产生2.5μg丙酮酸所需酶的量为一个SALT单位。四、实验操作1.标准曲线的绘制试剂管号012345丙酮酸标准液，mlSALT底物溶液，ml磷酸缓冲液，ml0.000.500.100.050.450.100.100.400.100.150.350.100.200.300.100.250.250.1037℃水浴中保温10min2,4-二硝基苯肼0.500.500.500.500.500.5037℃水浴保温20min氢氧化钠ml555555室温下静置10min蒸馏水调零点，于520nm处测吸光度1.为什么在制作标准曲线时要加入底物溶液2.为什么加入底物溶液的体积不同，对反应没有影响3.怎么计算丙酮酸的质量y=117.0x-0.733-50510152025303540455000.050.10.150.20.250.30.350.4丙酮酸微克数(μg)A520丙酮酸微克数-吸光度标准曲线2．SALT活力测定：洁净干燥试管4支，即测定管、对照管各2支试剂测定管对照管血清，mlSALT底物溶液，ml0.10.50.1____37℃水浴30min2,4-二硝基苯肼溶液，mlSALT底物溶液，ml0.5____0.50.537℃水浴20min0.4mol/L氢氧化钠溶液，ml5.05.0室温下静置10min1.4根干燥试管的用途是什么？2.样品测定为什么要使用对照管？3.样品测定的酶反应怎样终止？4.血清样品和底物在使用前最好提前放置于水浴中预热，保证反应时的温度的准确性5.反应温度和计时要准确SALT活力=测定管微克数—对照管微克数2.5×0.1（单位）五、注意事项1.2，4-二硝基苯肼可与有酮基的化合物作用形成苯腙2.吸量应准确，严格控制反应时间和温度。3.在测定SALT活力时，应事先将底物、血清在37℃水浴中恒温4.溶血标本不宜采用，因血细胞内转氨酶活力较高，影响测定结果。5．在测定时，如酶活力较大（大于100单位），应将样品稀释后再进行测定。六、专业词汇glutamic-pyruvictransminaseGPTalanineaminotransferaseALTglutamicoxaloacetictransaminaseGOTaspartatetransaminase,ASTenzymeactivityserumAminotransferase/transaminasecatalyzealanineα-ketoglutarateglutamicacidpyruvicacidalkalisubstrateABSTRACTObservingEnzymeActivityChangesofAlanineAminotransferaseinSampleAbstract:Objetcive:TodeterminetheactivityofserumALTinsample.Method:SALTwasmeasuredbyReitman-FrankelcolorimetricendpointmethodResults:ThenormalSALTactivityis()unit,theabnormalSALTactivityis()unit.Conclusion:TheactivityofSALTinabnormalsampleismuchhigherthanthatinnormalsampleKeyWords:alanineaminotransferase，aspartatetransaminase,enzymeactivity,serum,α-ketoglutarate,substrate,（1）drawcalibrationcurvetubesAddstandardpyrivicacidsolution,SALTsubstratesolutionandphosphatebufferWaterbathingat37℃for10’Add2,4-dinitratephenylhydrazineandwaterbathat37℃for20’AddNaOHsolutionandkeepinroomtemperaturefor10’Assayat520nm（2）determiningtheactivityofSALTNormaltubesAbnormaltubesseraSALTsubstratesolutionsera____Waterbathingat37℃for30’Waterbathingat37℃for30’2,4-dinitratephenylhydrazine2,4-dinitratephenylhydrazine____SALTsubstratesolutionWaterbathingat37℃for20’Waterbathingat37℃for20’AddNaOHsolutionandkeepinroomtemperaturefor10’AddNaOHsolutionandkeepinroomtemperaturefor10’Assayat520nmAssayat520nm