细胞培养技术.

分子细胞生物学技术一.细胞培养技术二.染色体研究技术三.荧光原位杂交技术四.流式细胞术五.细胞凋亡的研究方法六.DNA、RNA提取检测技术七.PCR技术八.分子杂交技术九.RNA干扰技术十.后基因组分析技术十一.生物芯片技术十二.转基因技术细胞培养技术细胞培养技术第一节细胞培养基本知识第二节细胞培养室的设置、设备和准备工作第三节细胞培养的基本技术第一节细胞培养基本知识一、前言二、培养细胞的特性三、培养细胞的生长过程四、培养细胞生长的条件一.前言1.细胞培养概念2.细胞培养的主要优点3.细胞培养的研究方面4.细胞培养的应用领域1.细胞培养(cellculture)概念从生物体内取出细胞或组织，在体外模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下进行孵育培养，使之生存和生长并维持其结构和功能的技术。始于20世纪初(1907年Harrison，1912年Carrel)现已广泛应用于生物学、医学各个领域，成为重要的基础学科之一。若以产生形成培养物的方法而言，可分为组织培养、细胞培养和器官培养。体内、外细胞的差异体内细胞：机体神经体液调节和其他类型细胞影响基因表达受到外来信号调节增殖过程中不断发生着分化（由一般到特殊）高度特化的结构和功能•体外细胞：失去机体神经体液调节和其他类型细胞影响细胞的许多外来信号被切断特定分化基因表达减弱或停止而进化中保守的增殖活动维持（由特殊到一般）与体内细胞结构和功能的差异特征：失去原有形态，分化特性减弱形态和功能趋于单一一定代数后衰老死亡，或发生转化，获不死性而成为能无限传代2.细胞培养的主要优点研究对象是活的细胞研究的条件可以人为地控制研究的样本，可以达到比较均一性研究的内容便于观察、检测和记录研究的范围比较广泛，多种学科均可利用细胞培养进行研究研究的费用相对较经济3.细胞培养的研究方面1）细胞内的活动：如能量代谢、DNA转录、调亡以及蛋白质的合成2）细胞内部与细胞外界之间的作用：如细胞对外界刺激的反应、药物对细胞的作用、细胞内产物分泌等3）细胞与细胞之间的相互作用：如形态发生、粘着作用、接触抑制、密度抑制等4）细胞内的流动：如信号的转导、钙离子的流动、RNA的移动、激素受体复合物的易位等5）遗传学：如遗传学分析、转染、转化等4.细胞培养的应用领域1）病毒学2）免疫学3）遗传学4）肿瘤学5）分化及发育6）细胞毒试验7）临床医学及生物技术方面的应用二、培养细胞的特性1.培养细胞的生长方式及类型2.培养细胞的生长特点贴附运动的接触抑制及生长的密度抑制贴附贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一以成纤维细胞为例，一般在细胞接种后，很快（5-10min）便可见细胞以伪足初期附着，与底物形成一些接触点；接着细胞逐渐呈放射状地伸展开，细胞体的中心部分亦随之扁平；最后细胞成为成纤维细胞的形态。运动的接触抑制及生长的密度抑制细胞相互接触后，如培养的是正常细胞，由于细胞的相互接触能抑制细胞的运动，这种现象称接触抑制（ContactInhibition）（恶性细胞则无接触抑制现象）。细胞接触汇合成片后，虽发生接触抑制，只要营养充分，细胞仍然能够进行增殖分裂，因此细胞数量仍在增多。但当细胞密度进一步增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多时，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响，则发生密度抑制，导致细胞分裂停止。因此细胞接触抑制和密度抑制是两个不同的概念，不应混淆。1.培养细胞的生长方式及类型体外培养的细胞，按其生长方式可分为两大类：贴附型为附着于底物（支持物）表面生长的细胞，生长中形成汇片。大多数细胞属此型。形态上失去在体内特有形态。大致分成以下四型：成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多形型悬浮型成纤维细胞型起源于中胚层的组织细胞，体外培养时属此型。如：纤维结缔组织、平滑肌、心肌、成骨细胞、血管内皮等。本型细胞形态似在体内生长的成纤维细胞，胞体呈梭型、不规则三角形或扇形，中央有卵圆形核，有数个胞质突起，生长时呈放射状。生长特点为细胞一般并不紧靠相连成片，而是排列为漩涡状、放射状或似栅栏状。上皮细胞型起源于内、外胚层的细胞，体外培养时呈此型。如：皮肤表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形态。形态上类似上皮细胞，细胞呈扁平不规则多角形，中央有圆形核，细胞彼此紧密相连成单层膜。生长特点为细胞之间紧密相靠、互相衔接，呈“铺路石”状，具有连接成片的能力。游走细胞型呈散在生长，一般不连成片，胞质常突起，呈活跃游走或变形运动，方向不规则。此型细胞不稳定，有时难以和其他细胞相区别。多形型有一些细胞，如神经细胞难以确定其规律和稳定的形态，可统归于此类。悬浮型少数细胞类型在体外培养时不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长，包括一些取自血、脾或骨髓的培养细胞，尤其是血液白细胞，以及癌肿瘤细胞。细胞在悬浮中生长良好，可以是单个细胞或为细小的细胞团，观察时细胞呈圆形。优点：可大量繁殖细胞、传代方便、易于收获细胞。三.培养细胞的生长过程1.单个细胞的生长过程：细胞周期2.细胞系的生长过程3.每代细胞生长过程2.细胞系的生长过程取自动物并置于体外培养中生长的细胞在其传代之前为原代培养或原代细胞。当细胞持续生长繁殖一段时间，到达一定的细胞密度后，就应当将细胞分离成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充更新培养液，此即称为传代或再培养。传代生长以后便成为细胞系。体外培养细胞寿命的过程一般可分为三个阶段：原代培养传代期衰退期原代培养：从体内取出细胞接种后到第一次传代。一般维持1－4周。传代期：传代大约数天至1周左右即可重复一次，持续数月，一般传10－50代。随后细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞进入衰退期。(Hayflick界限的概念)衰退期：细胞增殖缓慢以至完全停止，细胞死亡。无限细胞系:永久增殖。Hayflick界限•体外培养的细胞增殖能力不是无限的，传代次数有一定的界限，称为“Hayflick界限”。•传代次数与物种寿命有关：小鼠寿命3年，传代12次；龟寿命200年，传代140次。•传代次数与个体年龄成反比：人胚胎，40-60代；幼年，20-40代；成年，10-30代；早老病儿童，2-10代。无限细胞系多发生在传代期末或衰退期，由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化。转化的标志之一是细胞可能获得永生性或恶性性。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系。细胞获不死性后，核型大多变成异倍体。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。3.每代细胞的生长过程传代：培养容器中细胞增殖至一定密度后，分离出一部分细胞和更新营养液的过程一代:细胞接种后到下一次传代的一段时间在细胞一代中，细胞能倍增3～6次细胞一代的三个阶段：潜伏期、指数增生期、平台期实验研究多在指数增长期进行。潜伏期细胞接种培养后，先经过一个在培养液中呈悬浮状态的悬浮期。此时细胞胞质回缩，胞体呈圆球形。接着是细胞附着或贴附于底物表面上，称贴壁，悬浮期结束。初代培养细胞贴附慢，可长达10～24小时或更多；连续细胞系和恶性细胞系快，10～30分钟即可贴附。贴附是贴附类细胞生长增殖条件之一，细胞贴附后，还要经过一个潜伏阶段，才进入生长和增殖期。细胞处在潜伏期时，可有运动活动，基本无增殖，少见分裂相。初代培养细胞潜伏期长，约24～96小时或更长，连续细胞系和肿瘤细胞潜伏期短，仅6～24小时；细胞接种密度大时潜伏期短。当细胞分裂相开始出现并逐渐增多时，标志细胞已进入指数增生期。指数增生期这是细胞增殖最旺盛的阶段，细胞分裂相增多。指数增生期是细胞一代中活力最好的时期，因此是进行各种实验最好的和最主要的阶段。在接种细胞数量适宜情况下，指数增生期持续3～5天后，随细胞数量不断增多、生长空间渐趋减少、最后细胞相互接触汇合成片。因接触抑制而细胞运动停止、密度抑制而细胞终止分裂，细胞不再繁殖进入平台期。平台期细胞数量达饱和密度后，细胞停止增殖，进入停滞期。此时细胞数量不再增加，故也称平台期。平台期细胞虽不增殖，但仍有代谢活动，继而培养液中营养渐趋耗尽，代谢产物积累、pH降低。此时需做分离培养即传代，否则细胞会中毒，发生形态改变，重则从底物脱落死亡，故传代应越早越好。四、培养细胞生长的条件体外培养的细胞需要合适的环境和必须的条件才能生存、繁殖1.细胞的营养需要2.细胞培养环境条件3.无污染及无毒1.细胞的营养需要基本营养物质与体内相同，包括糖、氨基酸、维生素、无机离子、微量元素。促生长因子等物质血清中含有多种生长因子等活性物质，有利于多数细胞的存活和生长；但同时也有些组成不明、对细胞有害的成分。由培养基提供：液体和半固体，常用液体（市售干粉用去离子水配制）基本培养基，特殊培养基，选择培养基两类基本培养液生长培养液维持培养液基本培养液80～90％95～98％血清10～20％2～5％特殊培养基提供特殊细胞所需的特定营养成分和生长因子。1.基本营养成分含量改变：高糖2.加入中间代谢产物：辅酶A、ATP、丙酮酸钠3.激素：LH/FSH、胰岛素4.生长因子和细胞因子：EGF、FGF、BFGF5.特异性小分子物质：维甲酸6.LIF(白血病抑制因子)维持胚胎干细胞的未分化状态7.饲养层细胞（feederlayer）选择培养基（条件培养基）提供特殊的成分以造成只允许特定细胞生长的条件。1.特殊抗菌素：新霉素、潮霉素－用于筛选导入基因阳性克隆2.特殊物质：特异性生长因子（配合血清撤除、饲养层撤除等）－用于原代细胞筛选培养和干细胞诱导分化二.细胞培养环境条件温度35~37℃气体95%空气/5%CO2酸碱度pH7.2~7.4（酚红指示）渗透压=血浆渗透压290Osm/kg支持物玻璃、塑料、饲养层、微载体培养细胞浸浴于培养液，生长在置于恒温、恒湿的二氧化碳孵育箱中的玻璃或塑料容器中。3.无污染及无毒凡与细胞直接接触者（如培养器皿、底物、培养基等）或间接接触者（如配制培养基时使用的器皿、瓶盖、瓶塞等）不能具有细胞毒性，在选择器皿、材料时必须注意。污染问题包括细菌等微生物的污染、不同细胞类型的交叉污染及有害物质的污染。第二节细胞培养室的设置、设备和准备工作一、细胞培养实验室的设置二、细胞培养实验室的设备三、培养用品的清洗和消毒一、细胞培养实验室的设置1.无菌操作区无菌操作室超净工作台2.孵育区3.制备区培养液及有关培养用液体等的制备。4.储藏区5.清洗和消毒灭菌区二、细胞培养实验室的设备仪器：显微镜、CO2培养箱、干燥箱、水纯化装置、冰箱、离心机、天平、消毒器、烤箱、滤器等培养用器皿培养器皿：培养瓶、培养皿、多孔培养板培养操作有关器皿：贮液瓶、吸管、加样器其他用品：离心管、橡胶吸头、各种瓶管的胶塞、盖子、冻存管，不同规格注射器、烧杯和量筒及漏斗，酒精灯、喷壶等器械：手术刀、手术剪、血管钳、组织镊、眼科镊等三、培养用品的清洗和消毒1.培养用品的清洗玻璃器皿、玻璃滤器、胶塞、盖子等杂物、塑料器皿2.培养用品的消毒灭菌干热消毒湿热消毒紫外线消毒过滤除菌消毒消毒剂及抗菌素第三节细胞培养的基本技术一、无菌操作基本技术二、培养基配制三、冷冻细胞活化四、细胞传代培养五、细胞计数与存活测试六、细胞冷冻保存七、收到细胞的处理方式一、无菌操作基本技术1.实验进行前，无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%酒精擦拭无菌操作台面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%酒精擦拭无菌操作台面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以