细胞培养技术

1病毒培养技术任务1病毒的动物培养技术任务2病毒的禽胚培养技术任务3病毒的细胞培养技术2任务1病毒的动物培养技术动物的选择应当选择SPF动物。选择动物的条件下：①选用对病毒易感性高。②动物健康、体重、年龄尽可能一致，符合培养病毒要求。③遗传特性相似，实验结果具有一致性、准确性和可比性。④外购动物要了解当地动物群健康，饲养及免疫接种情况，接前要经过健康观察，以免误用带有病原体动物。31.皮内接种2.皮下接种3.肌肉接种4.静脉接种5.腹腔接种动物接种途径和方法4动物接种后的饲养管理与收获病毒1.接种病毒后的动物,每天观察和检查规定的各项指标，主要有精神、食欲、粪便、尿液、被毛状态、活动情况和接种部位的局部反应，每天测体温1次，做好记录。2.出现反应症候动物，按规定方法剖杀，采取含病毒高的组织脏器。5任务2病毒的禽胚培养技术能力目标：能够运用此项技术完成对特定病毒的培养。工序过程：如何完成此项任务？选择禽胚前孵育接种后孵育收获病毒禽胚的特点6各工序操作要点工序1禽胚的选择理想的禽胚是SPF鸡胚，常以非免疫鸡胚补充。工序2禽胚的接种前孵育孵化前消毒，温度37.5～38.5℃，相对湿度50%～60%，定时翻蛋，保证通风。孵化4～5d照蛋检查，淘汰无精蛋和死胚，孵化至所培养病毒需要的日龄即可接种。7工序3禽胚的接种途径各工序操作要点痘病毒和疱疹病毒，10～13日龄流感、新城疫、传支等，9～11日龄鹦鹉热衣原体和立克次氏体等，6～8日龄正粘病毒和副粘病毒，10～11日龄8工序4禽胚的接种后孵育接种后，蜡泪封孔，置37℃下孵化，每天照蛋2次以上，通过禽胚的病变初步确定病毒的存在及增殖情况，淘汰24h内死胚。各工序操作要点病毒感染指征：死亡充血、出血或出现坏死灶畸形出现痘斑9工序5病毒的收获各工序操作要点绒毛尿囊膜接种尿囊膜接种卵黄囊接种羊膜腔接种10照蛋11尿囊腔接种法12接种部位消毒13尿囊腔接种14收获尿囊液—每枚鸡胚收获尿囊液6～8ml15影响禽胚培养病毒的因素㈠种蛋质量1.病原微生物；2.母源抗体；3.抗生素㈡孵化技术1.温度控制在37～39.5℃。有些病毒对温度比较敏感，如鸡胚接种传染性支气管炎病毒后，不应超过37℃；2.湿度鸡胚孵化湿度标准为53%～57%，水禽胚孵化湿度比鸡胚高5%～10%；3.通风禽胚发育是需氧量较大，加强通风换气；4.翻蛋及时翻动促进发育等，但因地制宜。㈢接种技术通常鸡胚发育到13～14日龄，鸭胚发育至15～16日龄，尿囊液含量最高，平均6～8ml，羊水1～2ml。16任务3病毒的细胞培养技术子任务1细胞培养技术培养常用的细胞上皮细胞、成纤维细胞细胞培养的方式原代培养：从直接取自生物体细胞、组织或器官开始的培养。次代培养：将原代细胞培养物轻微消化后，再洗下分装至含新鲜培养液的培养管中继续培养。传代培养：将培养细胞以一个培养瓶转移或移植到另一个培养瓶中进行培养。17细胞培养技术（cellculture)细胞培养技术是选用各种细胞的最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。即：利用机械、酶或化学方法使活体动物组织或传代细胞分散成单个乃至2～4个细胞团悬液的培养，使之能继续生存、生长、增殖的一种方法。广义上:还包括组织培养、器官培养。18培养常用的细胞上皮细胞、成纤维细胞根据培养细胞的染色体和繁殖特性，可分为：⑴原代细胞直接利用新鲜动物组织经胰蛋白酶消化、分散，获得单个细胞，如鸡胚成纤维细胞，此细胞对病毒的检测最为敏感，但制备和应用不方便。⑵二倍体细胞（细胞株）由原代细胞或次代细胞选育出具有特殊生物学性质和标记的细胞，如猪肾细胞株（PK-15）和乳仓鼠肾细胞株（BHK-21）等。适用于病毒性生物制品的制备，常用于疫苗生产，安全可靠。⑶传代细胞（非二倍体细胞系、异倍体细胞）指不再保持原来细胞的二倍体细胞数，在体外可以无限传代的细胞，如人子宫癌细胞（HeLa细胞）和鼠肾腺癌细胞（RAG细胞）等。有致癌性，不能用于疫苗生产，多用于病毒的分离鉴定。191.培养液：生长液、维持液，Eagle氏液、RPMI-1640、199、DMEM、MEM等营养液。2.细胞接种量:适宜。3.pH：一般为7.0～7.4因细胞种类不同而略有差异。4.温度：一般为37～38℃。5.气体：氧气和二氧化碳。6.无菌条件：培养的全过程都要求严格的无菌条件。细胞培养的基本条件20各种组织是靠细胞间质黏合而成的，要获得分散的细胞，必须破坏细胞间质。分散细胞的方法的三种：⑴机械分散法：适用于细胞间连接较松的组织，如禽胚组织。⑵酶消化法：此法适用于原代细胞的制备及细胞的传代培养。⑶螯合剂分散法：一般只用于单层细胞的分散。211.单层细胞培养法用胰酶将剪碎的组织或传代细胞分散成2～6个成团的细胞，接种到培养瓶或培养板上，让细胞贴壁生长，静置培养或转瓶生长培养。2.悬浮细胞培养法（搅拌培养）通过振荡或转动装置使细胞始终分散悬浮于培养液内的培养方法。3.微载体培养通过搅拌悬浮在培养液内，使微小细胞在载体表面繁殖成单层的一种细胞培养技术，兼有单层和悬浮细胞培养的优点。细胞培养方法22犊牛肝脏单层细胞23鸡胚成纤维细胞培养—鸡胚的处理9-11日龄的鸡胚24鸡胚成纤维细胞培养—鸡胚的处理9日龄鸡胚11日龄鸡胚25鸡胚成纤维细胞培养—鸡胚的处理26鸡胚成纤维细胞培养—鸡胚的处理27子任务2病毒培养技术细胞的选择选择相应易感动物的组织细胞。细胞培养病毒条件⒈血清：促进细胞生长和贴壁的成分。⒉温度：多数为37℃。⒊pH值：pH在7.6～7.8⒋接毒量与接毒方法：一般按维持液的1～10%接入。28病毒增值指标与收获多数病毒在敏感细胞增殖可引起细胞代谢等方面的变化，发生形态改变，即细胞病变（CPE）。通常用CPE作为判定病毒毒力的指标，即计算病毒的TCID50。CPE显微镜下主要表现为：①细胞圆缩②细胞融合形成合胞体③轻微病变有些病毒在细胞上增殖并不产生CPE，可检查包涵体和血凝性作为病毒增殖的指标。29检测病毒正常细胞病变细胞30复习思考题1.解释概念：原代细胞二倍体细胞传代细胞单层细胞培养悬浮培养微载体培养2.用动物培养病毒时，如何选择动物？3.用禽胚培养病毒的接种方法有哪些？如何收获病毒？4.细胞培养法有哪些种类？有何特点？5.细胞培养病毒需要哪些条件？31细胞培养的必备设施无菌实验室超净工作台恒温培养箱其他设备（电热干燥箱、冰箱、水纯化装置、普通光学显微镜、倒置显微镜、细胞液氮储存器、离心机、恒温水域锅、消毒器、抽滤装置等）32⑴血清的主要成分血清是由血浆去除纤维蛋白而形成，血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长活性是达到生理平衡的。⑵血清的主要作用①提供基本营养物质②提供贴壁和扩展因子（FN、LN）③提供激素及各种生长因子（FGF、EGF、PDGF)④提供结合蛋白⑤对培养中的细胞提供某些保护作用血清33⑶血清的使用与储存使用前的处理56℃灭活30min→去除补体成分储存条件灭活后分装成小包装（10mL、20mL、50mL），－20℃储存；使用前4℃融化。使用浓度一般为5％～20％，最常用的是10％。血清34气体环境和pH氧（O2）参加细胞的三羧酸循环，产生能量以供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分。采用开放式培养时（碟皿或培养瓶松盖培养或培养板培养），一般要把细胞置于95％空气加5％二氧化碳的混合气体环境中。二氧化碳（CO2）CO2既是细胞的代谢产物，又是细胞生长所必需的成分，并与维持培养液的pH有关。35pH值大多数细胞适于在pH7.2～7.4条件下生长，低于pH6.8或高于pH7.6对细胞有害，甚至造成细胞退化或死亡。细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。随细胞数量的增多、代谢加强，释放CO2增多，使pH降低。为了维持培养基恒定的pH，多在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂。