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1实验一实验准备工作一、器材与药品（每实验室准备量）（一）普通器材名称数量备注普通天平1台大酒精瓶3只量筒1000ml、250ml各一只500ml盐水瓶1只玻璃棒2支火柴，标签纸，记号笔等（二）无菌器材名称数量备注100ml或250ml盐水瓶70只大翻70个10ml吸管3支5ml吸管5支1ml吸管1支青霉素瓶120只青霉素瓶塞120个（三）药品名称数量备注重铬酸钾2400g浓H2SO44000ml双蒸水5000ml由技术室提前准备青霉素10000单位/ml链霉素10000μg/mlNaHCO3，KCl，NaCl，Na2HPO4·12H2O，KH2PO4，结晶紫，甲醛，无水酒精等2二、实验内容（一）配清洁液成分量备注重铬酸钾2400g重铬酸钾溶于水中有时不能完全溶解，预先用2000ml热水助其溶解，再加入足量自来水，最后缓慢加浓硫酸。浓硫酸4000ml自来水20000ml切记：浓硫酸要缓慢加入，且边加边搅拌！（二）其他培养用液的配制及分工（学生分为三大组）1、RPMI-1640培养液成分量备注RPMI-16402袋搅拌溶解后过滤除菌，每瓶按100ml分装，塞好大翻，并注明名称配制日期和组别。每实验室20瓶。每小组1瓶。NaHCO34.0g2000ml大酒精瓶1只；无菌100ml盐水瓶20只。2、无菌分装5.6％NaHCO3成分量备注无菌5.6％NaHCO350ml按照3ml/瓶分装，每室16瓶，每小组1瓶。无菌操作。无菌青霉素瓶20只；无菌5ml吸管1支。3、无菌分装1％胰酶（技术室提供）按照1ml/瓶分装，每室15瓶。每小组1瓶。成分量备注无菌1％胰酶20ml按照1ml/瓶分装，每室16瓶，每小组1瓶。无菌操作。无菌青霉素瓶15只；无菌1ml吸管1支。34、Hanks＇液（母液由技术室提供）成分量备注A液100按照1：1：18比例进行配比混匀，总量为2000ml，过滤除菌，然后按照每瓶500ml分装，并注明名称配制日期，每室4瓶。B液100双蒸水1800无菌10ml吸管2支，1000ml量筒1只，1000ml大酒精瓶1只，无菌100ml盐水瓶20只。5、双抗成分量备注青霉素（80万U）2瓶配制双抗终浓度为：16000单位/ml；链霉素10000μg/ml。按5ml/瓶分装，瓶口贴好胶布作好标记，胶布上注明配制日期和组别。每室20瓶。每小组1瓶。4℃保存备用。链霉素（1g)1瓶无菌Hanks＇液100ml无菌5ml吸管1支，无菌青霉素瓶20只。6、血清的灭活和分装成分量备注无菌小牛血清150ml总量为150ml，56℃的水浴锅中进行热灭活，灭活时间30min，后按照每瓶5ml分装，并在瓶口处贴好胶布作好标记，胶布上写好日期和组别。每实验室30瓶。每小组2瓶。－20℃保存备用。无菌5ml吸管1支，无菌青霉素瓶30只。47、1×PBS配制成分量备注NaCl8.0g总量为1000ml，每瓶按70ml分装，用硫酸纸包好瓶口，待高压灭菌后第二天派人再换大翻保存。每实验室15瓶。每小组1瓶。KCl0.2gNa2HPO4·12H2O2.9gKH2PO40.2g去离子水至1000ml标好1000ml刻度的酒精瓶或1000ml容量瓶1只，无菌100ml盐水瓶15个。8、染色液成分量备注结晶紫0.5g溶解、混匀，滤纸过滤甲醛10mlNaCl0.8g无水乙醇50ml去离子水加至100ml250ml量筒1只，500ml盐水瓶1只。9、分装VTP（由技术室提供）成分量备注无菌VTP70ml无菌操作按4ml/瓶分装，并注明日期和组别。每实验室15瓶。无菌5ml吸管1支，无菌青霉素瓶15只。☆未特别说明上述试剂均放置2～8℃冰箱保存备用。☆每次实验除菌过滤的顺序：三个班的RPMI-1640先滤，然后再滤Hank＇s液。☆每组完成后统一收好，下次再分配到各小组。备注：常规实验室用品注意更换，包括酒精缸和酒精灯，棉球，一次性台布等。5实验二鸡胚原代成纤维细胞的制备与培养一、实验目的掌握鸡胚原代成纤维细胞的制备及培养的基本步骤；掌握活细胞的显微镜下观察；熟悉病毒在细胞内增殖的基本判断方法。二、实验原理离体动物组织通过温和的手段（机械和酶消化）形成单个细胞后，在适宜的外界环境中，包括温度、酸碱度和气相环境，并给予充足合适的营养条件，能生存、生长形成单层细胞，这种原代培养的细胞具有原来体内所具备的基本特性，比如肌肉细胞的收缩功能；上皮细胞的分泌功能等。通常把这种从体内取出组织细胞开始培养到第一次进行传代之前的这一段时期称为原(初)代培养。原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等的研究。三、实验材料（按2人/组的量发放）9～11日龄鸡胚1只，碘酒和酒精棉球若干，无菌器械一套，无菌无毒平皿2只；5或10ml吸管4支，1或5ml吸管1支，长青霉素瓶2只（带塞）；Hanks’液1瓶，RPMI-16401瓶，双抗1瓶（5ml）；胰蛋白酶1瓶（1ml），血清1瓶（5ml），5.6％NaHCO31瓶四、操作步骤1、碘酒和酒精棉球分别拭擦鸡胚气室外卵壳；2、取出两只无菌平皿，并标记①和②，待用。3、在RPMI-1640和Hank’s液中分别无菌操作以1％的量加入双抗，吸出10～15mlHank’s液至无菌平皿中备用；4、大镊子轻敲卵壳顶部然后小心去掉气室外卵壳；5、消毒镊子后小心撕破卵膜，两人互相配合取出鸡胚置于盛有Hank’s液的平皿①中，小心去头、内脏、爪和粘液及血球，洗涤后置于盛有Hank’s液的平皿②中，再充分洗涤；6、取出洗净的组织块置于大青霉素瓶中，在火焰附近用无菌眼科剪刀将其剪成约0.5～1mm3的小块（约250次），此时体积约0.5ml；用Hanks’液洗涤两次。67、加入1ml1％胰蛋白酶，用适量Hanks’液调整使其工作浓度为0.25％，5.6％NaHCO3调节pH至约7.3～8.0（肉眼观为肉红色，1ml吸管约3滴）盖上瓶塞，写好标记；8、将上述细胞瓶置于37℃水浴中，开始计时，约15～30min，其间缓慢摇匀以充分消化。消化停止的标志是：轻轻晃动后细胞悬起，呈云雾状，很快聚集成团，表明细胞活力好。9、消化结束后，取出，稍沉淀，缓慢吸出上清，用Hank’s液小心洗涤2～3次，可以尽量减少胰蛋白酶的残留量，然后加入RPMI-1640液约5ml，用小头吸管充分吹打，使细胞充分分散。吸上清；重复操作3～4次，收集细胞上清。10、（1）经四层无菌纱布或200目不锈钢钢网过滤后收集滤液，细胞计数，并调节细胞密度大约1×106/ml；（2）上述细胞悬液自然沉降，待未消化彻底的组织块沉入瓶底后，收集上清，并加入足量的小牛血清（终浓度为10％）。11、将上述制备好的细胞悬液平均分配到两个细胞瓶中，5ml/瓶，塞好螺口塞，注意生长面朝下，在非生长面上做好标记，包括细胞名称，接种培养时间，组别及姓名等。12、细胞统一置于本室指定的37℃，5％CO2孵箱中培养。13、24h后观察细胞生长情况，如果细胞长成单层，细胞界限清晰，大多数细胞为梭形并贴壁，布满细胞瓶的生长面，说明细胞生长状态良好。7实验三滤泡性口炎病毒（VSV）的增殖（纯培养）一、实验目的掌握病毒在细胞内增殖的基本判断方法。二、实验原理原代细胞最接近体内细胞的特性，因而对外界环境的变化也最敏感，因此比较适合病毒的增殖，药物的作用机制等研究。病毒在细胞内增殖的检测指标有细胞变化、红细胞吸附、细胞代谢改变、干扰现象、免疫荧光法检测等。由病毒引起的细胞病变称细胞病变效应（cytopathiceffect，CPE），常见的细胞形态学变化为细胞变圆、聚集、融合、裂解或脱落等。三、实验材料（按2人/组的量发放）200TCID50的VSV病毒0.1ml，5ml和1ml吸管各一支，维持液（含3％小牛血清的RPMI-1640液）。四、操作步骤1、上述原代成纤维细胞培养24h后，一旦细胞完全贴壁生长良好后，则轻弃培养上清，换上细胞维持液（含3％小牛血清的RPMI-1640），接种200TCID50的VSV0.1ml，在细胞瓶上标记换液时间，接种病毒量。正常对照也按照上述方法换上维持液。2、再继续培养，每间隔12～24h观察，直至全部细胞出现明显的病变，显微镜观察细胞脱落，圆缩，则可停止培养。3、收集全班的病毒培养物于100ml无菌盐水瓶中，写好标记，置于－20℃冰箱充分冷冻后再置于4℃冰箱或室温下解冻，该过程称为冻融。反复冻融三次后，细胞膜破坏，释放出胞内病毒。低速离心，弃细胞碎片沉渣，收集上清即为病毒悬液。留样测定病毒的TCID50。五、实验结果1、鸡胚原代成纤维细胞的显微镜下观察。2、VSV攻击鸡胚原代成纤维细胞后，细胞病变效应（CPE）的观察。3、病毒收获的方法。8实验四Hep-2细胞的传代培养一、实验目的掌握细胞传代培养的方法及其应用。二、实验原理体外培养的细胞由于细胞游出数量增加，单层培养细胞相互汇合，整个瓶底逐渐被细胞覆盖。这时需要进行分离培养，否则细胞会因生存空间不足或密度过大，营养障碍，影响细胞继续生长。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称之为传代；进行一次分离再培养称之为传一代。细胞培养传代根据不同细胞采取不同的方法。贴壁生长的细胞用消化法传代；部分贴壁生长的细胞用直接吹打即可传代；悬浮生长的细胞可以采用直接吹打或离心分离后传代，或用自然沉降法吸除上清后，再吹打传代。三、实验材料传代细胞：人喉癌细胞（Hep-2）（每两人一瓶）；所需溶液：PBS、VTP、RPMI-1640液、血清；其他：5ml吸管、10ml吸管、细胞瓶。四、操作步骤1、将已长成单层的细胞生长面朝上轻轻倒掉培养液，用PBS轻轻洗涤两次，注意吸管尖头不要伸到细胞瓶中。2、用上述吸管吸取1mlVTP加入细胞瓶中，铺满整个细胞生长面即可；室温或手握住消化，约3～5min。显微镜下观察细胞胞质回缩、细胞间隙增大后，即可停止消化。尽可能弃尽消化液，继续利用残余的消化液消化，直至细胞大部分易在外力作用下从细胞瓶表面脱落下来为止。3、加入少量RPMI-1640液于细胞瓶中，用小头吸管吹打瓶壁细胞以及脱落细胞使细胞充分均匀，吹打时动作要轻柔不要用力过猛，尽可能不要出现泡沫。4、计数：用吸管吹打细胞悬液，取少许细胞悬液与等量0.04％台盼兰混匀，在计数板上盖玻片的一侧加该细胞悬液，加样量不要溢出盖玻片，也不要过少或带气泡。计算细胞浓度。5、用RPMI-1640制备成1×106/ml浓度的细胞悬液，并按10％的量加入小牛血清。6、将上述细胞悬液分装5ml到新细胞瓶中，塞好塞子，标记后送培养箱培养，924h后观察。五、实验结果显微镜下观察Hep-2细胞生长良好，已长满单层，细胞呈不规则多边形，透光性良好。实验五VSVTCID50滴定一、实验目的掌握病毒TCID50滴定的基本原理和计算方法以及应用。二、实验原理多数病毒感染体外培养的细胞后，常引起细胞形态学改变，如细胞团缩、裂解和细胞肿大等，这种改变称为病毒致病变效应（cytopathiceffect，CPE），可以直接通过显微镜观察，亦可通过染色得以识别和判断。CPE的程度可间接反映病毒的毒力，因此利用这种特征可以用来测定病毒的毒力。即能在半数细胞培养板孔或试管内引起细胞发生病变所需的病毒量定义为病毒的50％组织细胞感染指数（50％tissuecultureinfectiousdose，TCID50）。测定时，首先在微量细胞板上培养敏感细胞，待细胞贴壁形成单层，弃上清。将待测病毒用维持液做10倍稀释后加入细胞单层，逐日观察，直至病毒产生的CPE不再进展为止。具体时间根据病毒的增殖特点而定，如肠道病毒增殖迅速，一般48h即可；VSV增殖也较快，因此，48h～72h也可以观察、染色、计算。三、实验材料细胞：Hep-2细胞株（实验四传代所得），自备/组。病毒：水泡性口炎病毒（vesicularstomatitisvirus，VSV），自备/组。试剂：维持液，PBS，VTP等自备/组。材料：细胞板（1块/组），tip头（2盒/排），微量移液器，5ml或1