细胞培养技术及常见问题

细胞培养技术及常见问题复旦大学附属中山医院中国生物医药技术服务中心※实验室细胞培养技术一、细胞培养的设备条件•无菌室密闭性好，方便消毒；干燥透气，但工作时和外界无空气对流。•超净工作台•CO2培养箱定期清洁消毒，保持湿度。•培养器皿的清洗与消毒浸酸6小时以上→流水冲洗15次→双蒸水浸洗3次→烘干、包装→消毒。二、培养基基本要求1、营养成分•氨基酸12种必须氨基酸，或需要添加谷氨酰胺。•单糖葡萄糖吸收最高，半乳糖最低。神经元培养需另外添加。•维生素•无机盐及微量元素2、促生长因子和激素3、渗透压260~320mOsm/kg范围内都适宜。4、PH7.2~7.45、必须使用三蒸去离子水6、血清牛血清适用于大多数哺乳类动物细胞•可分为：小牛血清、新生牛血清、胎牛血清•质量标准可向厂家索取质检报告＊总蛋白含量：不低于35~45g/L＊球蛋白含量：﹤20g/L，越低越好＊血红蛋白含量：越低越好•外观：土黄或棕黄色，清凉透明，无或少许沉淀，粘稠。＊大量沉淀物：污染或蛋白变性＊颜色为棕红色：血红蛋白含量高，有溶血＊液体稀薄：掺入的生理盐水过多•储存和使用＊热灭活高质量的胎牛血清不必热灭活，但培养ES细胞、平滑肌细胞时建议热灭活。＊分装为小包装，储存于-20°C，避免反复冻融。＊使用浓度，一般为5%~20%，常用10%。。•缺点＊过多添加血清，可能使细胞发生变化。＊血清中某些物质可能对细胞有毒性作用。＊不同批号血清之间质量有差异。7、促贴壁物质•鼠尾胶、明胶、FN等。制作时严格无菌操作。三、培养基的选择和使用•MEM成分简单，贴壁细胞首选。•DMEM分高糖型和低糖型。•IDMEM适合细胞密度低，生长困难的细胞。如杂交细胞的筛选，DNA转染后转化细胞的筛选培养。•RPM1640应用最广泛的培养基之一。悬浮细胞培养首选，主要针对淋巴细胞，也适合其他细胞。•199、109培养基成分齐全，培养效果较好。•F10培养基适合小鼠及人类二倍体细胞培养。•F12培养基适合单细胞分离培养及无血清培养。•McCoy’s5A培养基特别适合原代细胞及较难培养细胞的生长。四、其他培养用液1、平衡盐溶液•D-Hank’s液不含Ca2+、Mg2+离子，适合于配制胰酶溶液。•Hank’s液在5%CO2环境中会迅速变酸，不能放入CO2温箱。2、消化液•胰酶常用0.1%~0.25%，PH8~9•EDTA溶液抑制二价离子，破坏细胞间连接，适用于贴壁较牢的细胞。可与胰酶混合后使用，使用浓度为0.02%，配制时加碱助溶。•胶原酶溶液作用对象是胶原组织，不损伤细胞，常用于原代培养。使用浓度为0.1~0.3mg/L，或20万U/L，PH6.5。3、pH调整液•5.6%NaHCO3溶液•HEPES液增强培养基的PH缓冲能力3、抗生素•青-链酶素双抗预防G+、G-菌，青霉素使用浓度为10万U/L，链霉素为0.1g/L。•可加入卡那霉素预防支原体污染。•加入两性霉素抑制霉菌。•稳定性差，只有3~5天。•需做剂量反应实验，确定抗生素对培养细胞产生毒性的剂量水平。4、谷氨酰胺补充液•易降解，临用前添加。使用浓度为0.002mol/L。五、污染的预防和排除1、预防•严格遵守无菌操作规程，不抱任何侥幸心理。•配制的液体、分装的血清，每批都必须随机抽取样本做无菌试验，确认无菌才可投入使用。•及时冻存状态良好的细胞，以备不时之需。•培养试剂和操作器械要专人专细胞专用。•每次传代时留一瓶作备用，当传代细胞生长正常时再丢弃。2、污染的排除•及时高压灭菌污染的细胞，然后丢弃。（首选）•对于污染较轻，且来源困难的高价值细胞（1）用无抗培养基传代细胞，接种于多孔板中（2）将浓度梯度稀释后的抗生素加入孔内，例如，两性霉素B推荐下列浓度：0.25、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0mg/ml。（3）每天观察细胞毒性指标，如脱落、空泡、变圆等。（4）确定抗生素毒性水平后，使用低于毒性浓度2~3倍浓度的抗生素培养液培养细胞2~3代。（5）在无抗培养基中传代一次。（6）重复步骤4（7）在无抗培养基中培养4~6代，确定污染已被消除。六、细胞的冻存和复苏1、冻存•冻存液7份培养液、2份FBS、1份DMSO或甘油。•细胞密度（1~10）×106个/ml•步骤4℃30分钟→-80℃24小时→液氮•冻存细胞应选取处于对数生长期的细胞。2、复苏•液氮中取出的细胞应马上放入37℃水浴中，快速摇晃融化。•0.4%台盼蓝染色，检测细胞存活率。七、原代培养方法1、组织块法→血管平滑肌细胞2、胰酶消化法•冷消化法→骨骼肌成肌细胞组织块→4℃胰酶中浸泡过夜→37℃消化20分钟→收集细胞•热消化法→乳鼠心肌细胞组织块→37℃胰酶中分次消化，每次10~15分钟，并低速机械搅拌→收集细胞3、胶原酶消化→上皮类细胞•胶原酶工作浓度：50~200U/ml•加入3mM的CaCl2可增加消化效率。4、灌流法→血管内皮细胞、成年动物心肌细胞培养•胰酶、胶原酶可以单独或混合使用5、密度梯度离心法→淋巴细胞、单核细胞培养•Ficoll•Percoll可以得到较纯的单核细胞•分离液成分为多糖复合物，可能与细胞表面受体结合，影响后续实验结果。※如何收集细胞进行实验检测1、应该选用处于对数生长期，状态良好的细胞用于实验。2、细胞应处于70%左右融合，形态饱满，折光性好。提前24小时换无血清培养基，避免血清干扰，控制细胞生长速度。3、选择适当的分离液，避免所分离的细胞表面受体和其他标记分子被遮盖。4、酚红有类似雌激素作用，为避免类固醇反应，某些检测使用的细胞要用不加酚红的培养基。5、尽量使用传代数少的细胞进行实验，原代培养细胞建议在10代以内用于实验。6、在转染实验中，从细胞种植到转染后72小时期间，避免使用抗生素。7、为避免细胞老化和性状发生改变，请及时冻存细胞。慎重添加生长因子。8、用于转染的细胞，转染前一日应重新铺板，密度以铺满培养器皿60%左右。转染前4小时重新换液。9、转染后48小时即可进行靶基因表达检测。※细胞转染技术一、磷酸钙沉淀法1、方法转染前24小时，将对数生长期细胞以胰酶消化后，1×106个细胞接种于60mm培养皿培养。↓转染前2小时，配制DNA-磷酸钙共沉淀物质粒DNA+0.263ml无菌水+37µl2mol/L氯化钙溶液↓混匀，缓慢加入2×HBS，轻摇，30秒内加完，室温静置30分钟。↓弃去细胞培液，用PBS洗一次，加入DNA-磷酸钙沉淀物，室温静置20~30分钟，再加入5ml培液，37℃、5%CO2培养。↓培养24~48小时，可进行瞬时表达检测，或进行稳转克隆的筛选•操作简单，不需昂贵的转染试剂。•转染效率低，有些细胞不能用此方法转染。•一定要严格校准2×HBS缓冲液的PH，稍有偏差，无法形成合适的沉淀颗粒，将导致转染失败。二、电转法1、方法取融合70%左右的细胞，调整细胞密度为0.5~1.0×107/ml，用预冷的电转缓冲液洗2次↓取0.8ml细胞悬液放入0.4cm的基因脉冲小池中，取3~40µg质粒加入细胞悬液，混匀，冰浴10分钟。↓将基因脉冲小池放在电脉冲仪的正负极之间，电击一次。↓小池冰浴10分钟↓吸出细胞，并用适量的培液稀释细胞，37℃、5%CO2培养48小时后，表达检测或克隆化筛选。•电脉冲和场强的优化对于转染成功非常重要。•过高的场强、过长的电脉冲→细胞不可逆的损伤，•一般的，成功的电转过程都伴随高水平的（50%或更高）毒性。三、DEAE-葡聚糖转染法和基因显微注射法•DEAE-葡聚糖法不易形成稳转细胞系，仅限于瞬时转染。•基因显微注射法是建立转基因动物模型最好的方法，但需要特殊仪器设备，操作较复杂。四、阳离子脂质体转染1、方法提取、纯化质粒DNA，溶于无菌水中↓将（1~2）×105个细胞悬浮于2ml完全培养基中，接种在35mm培养皿或6孔板内↓37℃，5%CO2培养箱内培养18~24小时，细胞达到70%左右的融合↓在EP管中制备：A液：将2~20µl质粒DNA溶于100µl1640培养液中；B液：20µlLipofectin稀释于80µll1640培养液中。↓合并A液和B液，轻轻混匀，置室温15分钟↓弃去培养皿/板内的培养液，用无血清培养液洗一次↓加0.8ml无血清培液至Lipofectin-DNA混合物中，混匀，滴加在细胞上，轻轻混匀。↓37℃，5%CO2培养箱内培养5~24小时↓弃去转染液，加入2ml完全培养基，继续培养↓转染48~72小时，测定细胞瞬时表达情况，或于转染48小时后更换选择培养基，进行筛选，获得稳转细胞•用于转染的质粒DNA必须无蛋白质、无RNA和其他化学物质的污染，OD260/280比值应在1.8以上。•应用酚-氯仿抽提法制备的质粒DNA一般难以达到此标准，建议使用进口的DNA提取、纯化试剂盒。•健康的培养细胞和严格的操作确保转染的重复性。建议使用传代次数较少的培养细胞。•抗生素会在穿透的细胞中积累毒素，建议从细胞种植到转染后72小时期间避免使用抗生素。•针对不同的转染对象，受体细胞，选择合适的转染试剂。一般真核细胞Lipofectamine难以转染的细胞Lipofectamine2000昆虫细胞Ceiifection悬浮细胞DIMRIE-CRNA转染DIMRIE-C寡核苷酸转染Dligofectamine•Lipofectamine2000转染试剂：可对多数类型的细胞达到最高的转染效率和表达水平；对贴壁和悬浮细胞都有杰出的表现。无论是否存在血清都可以达到较高的转染效率。五、腺病毒载体1、方法选用合适的腺病毒载体（常用Ad2和Ad5）↓通过脂质体介导转染包装细胞↓转染开始后的72小时，将细胞置于选择培养基（如G418）压力下培养→获得产病毒的稳转细胞克隆↓在HEK293细胞中扩增病毒↓氯化铯密度梯度离心法纯化病毒↓测定病毒滴度。（病毒滴度相当于含克隆的最高稀释度的孔中所含克隆数×稀释度。例如，在106稀释度的孔中含有4个克隆，即滴度为4×106cfu/ml）↓将病毒加入靶细胞中，共同孵育，24小时后换液，48~72小时后加抗性筛选。•收集的包装病毒上清中含有病毒。•病毒上清的处理应在冰上操作。•过滤上清使用0.45µm醋酸纤维素滤膜（低蛋白结合性），硝酸纤维素滤膜结合病毒膜蛋白并破坏病毒，不要使用。六、稳转细胞克隆的筛选根据不同基因载体中所含抗性标志选用相应的药物，常用标志物有潮酶素（Hygromycin）和新酶素（neomycin）1、药物筛选（以G418为例）100mgG418溶于2ml去离子水中，过滤除菌，-20℃保存↓转染后48~72小时，细胞接近完全融合时以1：4传代↓继续培养细胞至70%左右融合↓移去培液，加入含800µg/ml的G418培液筛选（具体浓度以预实验确定），以未转染细胞作对照。↓约3~5天后，当细胞死亡达到70%↑时，再次换液，G418浓度下降到100~300µg/ml，以维持筛选作用。↓连续培养10~20天后，抗性克隆形成，待克隆长大后进行转移和扩增。2、克隆细胞的转移和扩增显微镜下标记好克隆的位置，移去培养基，用无血清培液洗涤2次。↓吸取2~5µl0.25%胰酶滴加在细胞克隆位置上，反复吹打后，吸取液体。↓将细胞悬液加入含2ml，浓度为250µg/mlG418的24孔板中，37℃，5%CO2培养箱内培养。↓待细胞长满后，进一步扩增，鉴定。谢谢大家