细胞培养的个人体会2013.9.10

肖飞(Jinanuniversity，[e-mail])内部交流，仅供参考细胞培养的个人体会2如何做好实验？“播下一种习惯，你将收获一种性格；播下一种性格，你将收获一种命运”。威廉.詹姆士个人体会：题外话：1、“养成良好的实验习惯”。实验前：查资料，计划好，充分准备。实验中：认真操作，关键点作好记录。（可写在草稿本上）。实验后：整理实验物品，用过的东西要放回原位，及时清理垃圾，抽空根据草稿本详细写下实验记录。（写在实验记录本上）实验其间，听从老师和师兄、师姐的安排和管理！32、“养成独立思考、独立解决问题的习惯”全面提高自己的能力，力求能独挡一面。遇到问题，首先自己想办法去解决。3、“养成良好的心态”“雄心”:有抱负和理想，做好文章。“恒心”：坚持。“平常心”：从容淡定，慢而不拖，快而不乱.4、“苦干+巧干”苦干：多练习，熟能生巧。“做”巧干：多总结，掌握规律。“思”4内容提要1.细胞培养简介2.细胞的复苏和冻存细胞的复苏细胞的冻存3.细胞的换液与传代个人方法无菌操作技术细胞计数和接种5体外培养（invitroculture）：是将活体成分或其寄生体内取出，放在类似于体内生存环境的体外环境中，让其生长和发育的方法。可分为器官培养、组织培养、细胞培养三种类型。细胞培养分为原代培养和传代培养。体外培养6简化环境因素、排除了体内实验时一些复杂的因素的影响，利于应用各种物理、化学和生物等外界因素探索和提示细胞生命活动的规律；提供了大量生物性状相同的细胞，特别是人的活细胞材料作为研究对象。经济、便利，解决了不能用人做实验的问题。缺点是无法模拟体内的情况，结果有局限性。细胞培养的特点7CO2培养箱细胞培养基本设备定期清洁，换水。拿出细胞及时关好门，保持CO2浓度。短时不用，将光源调至最小，避免反复开关。长时不用，及时关电源。使用注意问题：倒置显微镜8超净工作台使用前紫外照20-30分钟。使用时别忘关紫外，防止灼伤。定期换水，保持干净的水。使用前检查水位，不足补充纯水。最好细胞培养专用一个灭菌锅。使用注意问题：高压灭菌锅91.培养瓶、培养管、细胞培养板、蓝盖瓶、吸管；2.离心管、细胞冻存管、1ml、5mlEP管；3.血细胞计数器；4.恒温磁力搅拌器、恒温水浴振荡器；5.刀、剪、镊解剖用具，200目不锈钢网；细胞培养的基本用品1011大多数培养基是建立在平衡盐溶液(BSS)基础上，添加了氨基酸、维生素和与血清中浓度相似的营养物质。选择培养基很重要，不同细胞需要适合的培养基。常见的培养基有：DMEM、F12、DMEM/F12、1640等。基础培养基12一般是从牛的血液中提取，含有丰富的营养养物质。常用的胎牛血清（FetalBovineSerum,FBS),使用前分装50ml离心管，-20℃保存。注意解冻分装前请混合均匀。使用时放在4℃冰箱解冻，需1-2天。血清13血清和基础培养基按一定比例混合，一般配制含10-15%血清的培养基，用于细胞培养。如取20ml胎牛血清，同时加入180mlDMEM基础培养基，即可配成200ml含10%胎牛的DMEM.完全培养基141.器皿加洗洁精浸泡数小时后，用自来水冲洗9次，然后蒸馏水冲洗3次。2.烘干：洗干净后烘干。3.包装：用牛皮纸或布包装。消毒前贴上灭菌条，条上写明日期、物品、所有者。可重复利用物品的清洗和灭菌154.高压灭菌：包装好的器皿装入高压锅内，121℃，维持30分钟。5.灭菌后烘干：高压消毒后器皿会被蒸气打湿，要放入烤箱内烘干备用。注意：泡酸（重铬酸钾120g：浓硫酸200ml：蒸馏水1000ml）浸泡12小时。（玻璃器皿第一次洗需要用，以后可以省这一步）。16细胞的复苏和冻存17细胞复苏与冻存的原则是“慢冻速融”。复苏细胞时，速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5℃～0℃。冻存细胞时，向培养基中加入保护剂二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，减少细胞冰晶的形成。复苏与冻存的原则181、准备好37℃水浴烧杯。2、将冻存于液氮中的冻存管取出，迅速放入37～40℃水浴中使其在1min内融化。3、无菌条件下打开冻存管，取细胞悬液至离心管中，补加5mL培养液，1600rpm低速离心5min。4、去上清，加入新鲜培养液适量，吹打成细胞悬液，转入培养瓶中，置37℃培养。复苏的标准方法19复苏前，准备好含有5mL培养基的培养瓶，放入37℃培养箱。1、准备好40℃水浴烧杯。2、将冻存于液氮中的冻存管取出，还原保存盒放入液氮中。将取出冻存管迅速放入水浴中，迅速摇晃加速其融化，放在水浴中，5min钟内须完成。3、将冻存管放入15mL离心管（剪去底部的旧离心管）中，1500rpm，离心3min。4、从离心管中取出冻存管，小心吸去上清，从培养箱中取出培养瓶，加入37℃的培养液1mL，吹打30次，转入培养瓶中，置37℃培养。个人方法201、胰酶消化，加含血清培养基终止，离心。2、去上清，加入冻存液1.5mL，吹打60次，转入冻存管。3、冻存管放入4℃30分钟----20℃60分钟----80℃16-18小时(或隔夜)---投入液氮中。3、或冻存管置于程序降温盒中，放置-80℃，---投入液氮中。冻存的个人方法：附：冻存液个人配方：培养基：血清：DMSO普通细胞可用：7份：2份：1份细胞脆弱可用：5份：4.2份：0.8份21细胞的换液和传代22贴壁期:0.5-4h潜伏期:5-24h对数生长期:24-96h停止期（衰老期）:96h以上贴壁生长细胞的生长过程新鲜培养基对数期停止期（红）（淡红略黄）（黄）23贴壁生长细胞的换液全换液：完全吸除瓶内旧培养液，向瓶内加入约4-6mL培养液。置37℃培养，适合于普通细胞。半换液：吸除瓶内一半的旧培养液，向瓶内补加入约3mL培养液。置37℃培养。适合于生长较慢的细胞。当细胞没有满细胞培养瓶时，而培养基颜色变成略黄状态时，说明营养消耗不少，环境酸性较强，为减少其对细胞损伤，须对细胞补充新鲜培养基。死细胞较多时，需要除掉死细胞。换液时机：换液方法：241.细胞铺满瓶底80%，吸除瓶内旧培养液，向瓶内加入少量约1～2mL消化液（一般含胰蛋白酶、EDTA），轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍所有细胞表面；2.在37℃环境下孵育1-2min，把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大。3.加入含血清培养基，终止消化，用弯头吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，使之脱落，吹打成细胞悬液。4.转入离心管，1000-2000rpm，离心5min。5.去上清，加入新鲜培养液适量，吹打成细胞悬液，以1：2或1：3的比例接种在新的培养瓶内，置37℃培养。传代的标准方法251.细胞铺满瓶底约80%，吸除旧培养液，向瓶内加入600uL胰酶，轻轻摇动培养瓶，使消化液流遍细胞表面；2.吸除胰酶，在培养箱中孵育1-2min，把培养瓶放置显微镜下进行观察，发现胞质回缩、细胞间隙增大。3.加入新鲜培养液2mL，吹打成细胞悬液，以1：2或1：3的比例接种在新的培养瓶内（已预加新鲜培养基3ml)，置37℃培养。(比标准方法省2步)传代的个人方法(消化+机械吹打）26细节决定成败，要注意的细节很多。详细的内容可参考“细胞培养无菌技术”PPT、视频。无菌操作技术（关键技术）个人体会：1.特别注意Vulnerableareas，吸管吸取液体时尽量不接触瓶口。2.尽量避免在培养皿和所有瓶口的上方操作。3.同一根吸管不应连续用于两个不同的液体或细胞系。4.只要吸管接触瓶外面任何地方都要丢弃，换新管。27常见细胞污染A:正常B:杆状细菌污染C:球状细菌污染D:丝状真菌污染E:酵母污染281号区5号区细胞计数1、使用计数板人工计数2、使用自动细胞计数仪电脑计数29细胞密度=(1+2+3+4)/4万个细胞每毫升1342230合适细胞密度是实验成功关键31合适的细胞培养液体积32常用细胞接种密度计算常见问题：现有4ml细胞悬液，细胞计数的结果为110万个/ml，现在要接种到96孔板中，若每孔2万个细胞，请问如何配制实验所需的细胞悬液?传统算法：本来是96孔，实际要多预留一些，若多算10孔的话，共106孔。1、所需总细胞数：2万X106=212万2、所需总体积：100ulX106=10.6ml就是说要把212万个细胞放入总体积10.6ml培养基中。需要取212万除以110万个/ml=1.93ml细胞悬液，补加10.6-1.93=8.67培养基。混匀后，每孔加入100ul.33个人体会：所需细胞悬液为：配制的总体积除以稀释倍数即可细胞悬液稀释倍数:110万/ml除以2万/100ul=5.5倍所以需要取10.6ml除以5.5倍=1.93ml的细胞悬液。补加10.6-1.93=8.67培养基。混匀后，每孔加入100ul.原理自己慢慢想！34细胞培养中药物加入的计算常见问题：NGF储存浓度为20ug/ml,其作用在细胞的终浓度为100ng/ml,现在有8个孔细胞需加入NGF作用，每孔体积500ul,如何配制实验所需的药物浓度?传统算法本来是8孔，实际要多预留一些，多算1孔，共9孔。1、所需总体积：500ulX9=4.5ml2、所需总药物：4.5mlX100ng/ml=450ng就是说要把450ng的NGF放入总体积4.5ml培养基中。需要取450ng除以20ug/ml=0.0225mlNGF储存液，补加4.5-0.0225=4.478培养基。混匀后，每孔加入500ul.35个人体会：所需NGF储存液为：配制的总体积除以稀释倍数即可所以需要取4.5ml除以200倍=0.0225ml的NGF储存液。补加4.5-0.0225=4.478培养基。混匀后，每孔加入500ul.36Thanks!