细胞培养的基本技术

细胞培养的基本技术申艳娜：办公室：医学检验学院病原生物学教研室E-mail:[e-mail]2主要内容基本操作技术和要求原代培养传代培养和细胞系的维持培养细胞生长性状的观察细胞冻存与细胞复苏微生物污染的检测与排除3一、基本操作技术和要求1.培养前准备实验前要制定好实验计划和操作程序；计算好有关数据；准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。5无菌操作2.培养室和超净台的消毒无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30～50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。6无菌操作培养室和超净台的消毒消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。7无菌操作3.洗手和着装进入无菌培养室原则上需彻底洗手并按外科手术要求着装；无菌服、帽子和口罩每次实验后，均需清洗、消毒；操作前要用75％酒精或0.2％新洁尔灭消毒手和前臂。8无菌操作4.无菌培养操作火焰消毒在无菌环境进行培养或做其它无菌工作时，首先要点燃酒精灯。以后一切操作，如按装吸管帽、打开或封闭瓶口等，都需在火焰近处并经过烧灼进行。9无菌培养操作操作时，动作要准确敏捷，但又不必太快，以防空气流动，增加污染机会。不能用手触及已消毒器皿，如已接触，要用火焰烧灼消毒或取备品更换。10无菌操作无菌培养操作工作台面上的用品要放置有序、布局合理，一般酒精灯位于中间，右手使用的在右侧，左手使用的在左侧。移液管、尖吸管不应交叉使用，防止交叉污染。培养细胞的取材取材的基本要求：1.尽快培养2.严格无菌操作3.减少对细胞的机械损伤4.去除坏死组织，避免组织块干燥5.培养液营养丰富6.易培养的组织成功率高7.详细记录取材的基本器材和用品1.眼科组织弯剪、弯镊、手术刀2.小瓶装无血清培养基、Hanks液3.小烧杯4.培养皿各部位组织的取材皮肤和黏膜内脏和实体瘤血细胞骨髓、羊水、胸水、腹水内细胞鼠胚组织鸡胚组织组织材料的分离细胞悬液的分离方法：血液、羊水、胸水、腹水等细胞悬液离心分离，500~1000r/min，5~10min组织材料的分离组织块的分离方法1.机械分散法2.剪切分离法3.消化分离法机械分散法纤维成分很少的组织，如脑组织、部分胚胎组织以及一些肿瘤组织。方法：1.剪刀剪切，吸管反复吹打分散组织细胞。2.组织放在注射器内通过针头压出。3.注射器针芯挤压通过不锈钢筛网（50目、200目、400目）剪切分离法组织块移植培养时，将组织剪成或切成小块（1cm3）用眼科剪反复剪切组织至糊状，吸取培养液反复吹打，低速离心去上清，再分离培养。消化分离法——胰蛋白酶消化法用于消化细胞间质较少的软组织，如胚胎、上皮、肝、肾等，同时也用于培养的细胞。pH、温度、浓度、组织块大小和硬度。0.1~0.5%，常用0.25%pH=85mm3胚胎类软组织，0.25%胰蛋白酶，37℃，20-30min即可。钙、镁离子及血清对胰蛋白酶有抑制作用。分次消化EDTA较胰蛋白酶缓和，从组织环境中吸取钙、镁离子，破坏组织的完整性。0.02%，用不含钙、镁离子的BSS配置。不能被血清中和，用洗涤、离心方法去除。胰蛋白酶与EDTA联合使用提高效果，1:1或1:2消化分离法——胶原酶法胶原酶（collagenase）是从溶组织梭状细胞芽孢杆菌提取制备的。对细胞间质有消化作用而对上皮细胞影响不大。分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型及肝细胞专用胶原酶Ⅳ型。胶原酶Ⅱ型—肝、骨、甲状腺、心脏、唾液腺胶原酶Ⅲ型—广泛不分型的复合胶原酶—肿瘤细胞常用量200U/mL（1mg/ml）或0.03%~0.3%。37℃震荡，肿瘤组织或致密结缔组织4-48h，易消化组织15~45min。二、原代培养也叫初代培养，是从供体取得细胞后在体外进行的首次培养。生物学特性最接近和反映体内生长特性，适合做药物测试、细胞分化等试验研究。原代培养的组织由多种细胞成分组成，细胞间存在很大差异，生物学特征不稳定，需对细胞传代后做对比性试验研究。组织块培养法适用于组织量少的原代培养，如牙髓细胞培养。—取材修剪冲洗—剪切成1mm3小块—移入培养瓶（可预先涂布薄层血清或鼠尾胶原）—分布组织小块间距5mm（50ml培养瓶放20~30块组织块）—翻转培养瓶并加适量培养液，37℃静止2-4h—翻正培养瓶进行培养（动作轻巧，液体缓慢覆盖培养块）—原代细胞生长（3-5天换液去除漂浮组织块和血细胞）消化培养法——组织消化分散法器官培养26三、传代培养和细胞系的维持原代培养：也称初代培养从供体取得组织细胞后在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步。传代培养细胞培养过程中，细胞增殖而数量增加，单层培养细胞相互汇合，覆盖整个培养瓶，需进行分离培养。细胞由原培养瓶内分离稀释后传到新的培养瓶的过程称传代。进行一次分离再培养称之为传一代。27细胞传代方法1.贴壁细胞的消化法传代：采用酶消化法传代。步骤：（1）吸除瓶内旧培养液（2）加入消化液（胰蛋白酶或与EDTA混合液）（3）37℃或室温以上消化2-5min（显微镜下观察胞质回缩、细胞间隙变大终止消化）（4）吸走消化液，加入含血清的培养液（5）用吸管反复吹打形成细胞悬液（6）计数，接种在新的培养瓶内。细胞传代培养—消化法2.悬浮细胞的消化法传代：采用直接传代或离心收集细胞后传代。（1）直接传代：使悬浮细胞沉淀在瓶底，将上清吸掉1/2~2/3，用吸管吹打形成细胞悬液在传代。（2）离心传代：收集到离心管中800~1000r/min，5min，去上清，加新培养液吹打称细胞悬液，传代接种。3.部分贴壁细胞：直接吹打或消化传代原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系组成。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞系（finitecellline）；如果具有无限生存能力，则称为连续细胞系（continuouscellline）。细胞系31细胞系的维持：“换液、传代、冻存”1.细胞系档案要记录好2.在维持传代时要注意保持规律性3.多种细胞系传代避免交叉污染4.要有充足的冻存储备培养细胞的纯化1.自然纯化：利用某一种类细胞的增殖优势，去除其他细胞，达到细胞纯化的目的。成纤维细胞具有增殖优势。恶性肿瘤可以通过此方法。2.人工纯化：利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞生长，从而达到纯化细胞的目的。酶消化法：成纤维细胞易消化机械刮除法：分区或分片生长反复贴壁法：贴壁速度不同，成纤维细胞先贴壁克隆法：单个细胞分别克隆生长培养基限定法：条件培养基或限定性培养基筛选流式细胞仪分离法免疫磁珠分离法培养细胞生长性状的观察1.常规观察2.活细胞的观察3.细胞生长状况的观察35常规观察细胞经原代培养后及传代或换液后均需进行连续的、动态性观察。每日或隔日观察一次，并做好相关记录。活细胞形态数量移动情况36常规观察1.培养液2.细胞生长概况3.细胞形态变化4.微生物污染37常规观察——培养液颜色和透明度的变化正常培养液的颜色新鲜培养基，桃红色，pH为7.2-7.4产生代谢产物，浅黄色，偏酸培养液很快变黄原因细菌污染培养瓶洗刷不彻底接种细胞密度过大38常规观察——细胞生长增殖潜伏期或适应期：细胞系24h以内；原代培养几天-几周。对数生长期：长满80%及时传代；培养液变黄。平台期:细胞粗糙，细胞内颗粒状堆积物，细胞脱落。39常规观察——细胞形态变化生长状态良好的细胞透明度大折光性强轮廓不清有时可见到细胞分裂相40成纤维型细胞形态41上皮型细胞形态42常规观察——微生物污染微生物污染一般发生在传代、换液和加药后。在进行上述操作后24～48小时要密切注意是否有污染发生。43常规观察——微生物污染细菌污染：培养液浑浊、可见细菌；霉菌、真菌污染：培养液浑浊、可见菌丝；支原体污染：培养液不浑浊，细胞生长变缓慢、胞质内颗粒增多，有中毒表现。44主要内容培养细胞的常规观察活细胞的观察细胞生长状况的观察45活细胞的观察相差显微镜观察46主要内容培养细胞的常规观察活细胞的观察细胞生长状况的观察细胞计数培养的细胞在一般条件下要求有一定的密度才能生长良好，所以要进行细胞计数。计数结果以每毫升细胞数表示。细胞计数的原理和方法与血细胞计数相同。•血细胞计数板：手工计数细胞•电子细胞计数仪：自动计数细胞计数：1、准备计数板：用无水乙醇或95%乙醇清洁计数板及盖片，擦拭干净，将盖玻片盖在计数板上。2、制备单细胞悬液：保证细胞密度大于104个/ml。3、加样：将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。不要溢出盖玻片也不能溢入两侧的玻璃槽内，不要有气泡。4、计数：在显微镜下，用10×物镜观察计数板四角大方格中的细胞数，压线细胞只计左侧和上方的。5、计算：公式：细胞数/ml＝(4大格细胞总数/4)×104注意：镜下偶见由两个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备细胞悬液。50细胞生长状况的观察细胞生长曲线细胞生长曲线：以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，连接成的曲线。标准的细胞生长曲线近似”S”形：滞留期、对数生长期、平台期（生长抑制）。细胞对数生长期：在生长曲线上细胞数量增加1倍时间为细胞倍增时间，此区间即细胞对数生长期，细胞传代、试验等多应在此期间进行。52细胞生长状况的观察细胞分裂指数：是计算分裂细胞占全部细胞中比列的方法，用以表示细胞增殖的旺盛程度。细胞贴壁率：适用于观察贴壁细胞，主要反映细胞的生存能力和部分底物材料的生物相容性。细胞生长状况的观察—细胞周期G2MG0G1s0DNAAnalysisCount2004006008001000G0G1sG2MDNAcontent2N4N研究细胞动力学、细胞的DAN合成代谢和有丝分裂。每一个增值过程都要经过一个周期来进行，包括：有丝分裂期（M期）分裂间期（生长期）：生长前期（G1)、DNA合成期（S）、生长后期（G2）54细胞生长状况的观察细胞周期细胞周期和细胞群体倍增时间不同倍增时间是指在对数生长期细胞数量增加一倍所需的时间。细胞周期是指一个细胞的分裂生长周期时间，一般情况下短于细胞倍增时间。55细胞生长状况的观察细胞周期流式细胞仪测定法56主要内容无菌操作传代培养和细胞系的维持培养细胞生长性状的观察细胞冻存与细胞复苏微生物污染的检测与排除57细胞冻存与细胞复苏概述细胞低温冷冻贮存是细胞室的常规工作。细胞冻存与细胞传代保存相比可以减少人力、经费，减少污染，减少细胞生物学特性变化，最大限度的保存细胞活力。58细胞冻存与复苏原则：慢冻快融当细胞直接降到零度以下，可引起：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶，会造成细胞膜、细胞器的损伤和破裂。冻存细胞时要缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶。59低温保护剂的应用采用甘油或二甲基亚砜（DMSO）做保护剂。常用DMSO，一种渗透性保护剂，易穿透细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点。延缓冻结过程，能使细胞内水分渗出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。60细胞冻存方法1.预先配制冻存液：含20%血清培养基，10%DMSO，DMSO液用培养液配好，避免因临时配制产热而伤害细胞。2.取对数生长期细胞（冻存前一天换液），经胰酶消化后，加入适量冻存液，用吸管吹打制成细胞悬液（5-10）×106个/ml)。3.加入1-1.5ml冻存细胞液于冻存管中，密封后标记冷冻