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细胞培养中的细节问题Donveup基础篇-无菌操作基本技术1.实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminarflow)以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。2.无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。3.小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。4.工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少ClassII)。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。5.定期检测下列项目：5.1.CO2钢瓶之CO2压力5.2.CO2培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。5.3.无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。6.水槽可添加消毒剂(Zephrin1:750)，定期更换水槽的水。基础篇-实验用品1.种类︰1.1.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与pasteurpipet外，其它均为塑料无菌制品。1.2.TC级培养盘表面均有coating高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有Tflask，plates,dishes,rollerbottle等，依实验需要使用。1.3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml1.4.塑料离心管:15ml,50ml，均有2种不同材质，其中polypropylene(PP)为不透明材质，polystyrene(PS)为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。1.5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉废弃培养液等。1.6.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,500ml,1000ml2.清洗︰2.1.新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05NHCl浸泡数小时，洗净后才开始使用。2.2.用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。3.灭菌︰3.1.实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃,15lb,20分钟，置于oven中烘干。3.2.实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌170℃,4小时。3.3.液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高压灭菌121℃,15lb,20分钟处理。基础篇-培养基1.液体培养基贮存于4℃冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃水槽中温热。2.液体培养基(加血清)存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。3.粉末培养基配制(以1升为例)：3.1.细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养基之配制体积为900ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。3.2.材料：纯水(milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)，粉末培养基，NaHCO3，电磁搅拌器无菌血清瓶，0.1或0.2mm无菌过滤膜，pH计，真空泵，CO2气体3.3.步骤：3.3.1.取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。3.3.2.称取适量之NaHCO3粉末溶于200mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约3-5分钟。3.3.3.将溶解且含饱和CO2之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之pH应为7.2-7.4，除非pH值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2气体调整pH。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，pH会升高0.1-0.2。3.3.4.以0.1或0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4℃。(血清亦可加入培养基中一起过滤)3.3.5.配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。附-配制培养基之生长测试材料：MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)6-wellTCplate(or35mmTCdish)methanolglacialaceticacid10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)步骤：1.以待测试培养基培养MDCKcell，接种MDCK细胞于6-wellplate(或35mmTCdish)中，每个well接种1×102活细胞，同时作对照组实验。2.接种5～7天后，在100倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。3.去除培养基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇：冰醋酸﹦3:1)，室温下静置10min。4.去除固定液，水洗二次。5.加入1ml10%Giemsasolution，，室温下静置染色2-3min。6.去除染液，水洗二次。7.以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。基础篇-抗生素1.细胞库之细胞培养基不加抗生素1.1.培养自ATCC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。1.2.培养自其它实验室引进之细胞株，制作tokenfreeze前培养基须添加抗生素，待tokenfreeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。2.寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素(penicillin100units/ml+streptomycin100ug/ml)。3.若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin会抑制mycoplasma生长。4.去除细菌污染之抗生素混合配方:penicillin250units/ml,streptomycin250ug/ml,neomycin250ug/ml,bacitracin2.5units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。5.抗生素使用种类与浓度：工作浓度.储存温度.杀灭细菌penicillin100units/ml-20℃G(+)bacteriastreptomycin100ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteriachlotetracycline50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteriagentamicin50ug/ml-20℃G(+)andG(-)bacteria,mycoplasmaamphotericinB2.5ug/ml-20℃yeastandmoldsnystatin50ug/ml-20℃yeastandmoldsfungizone2.5ug/ml-20℃yeastandmolds基础篇-血清1.血清必须贮存于–20～-70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45ml分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。2.一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。3.瓶装(500ml)血清解冻步骤(逐步解冻法):-20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沈淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。4.heat-inactivation是指56℃,30分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsandplatelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecelltype。5.勿将血清置于37℃太久，若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。6.血清之沈淀物6.1.凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。6.2.显微镜下观察之“小黑点”：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是“小黑点”，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在37℃中欲培养此“微生物“，但在37℃环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。附-血清之生长测试材料：MDCKcell(ATCCCCL-34或CCRC60004)a-MEM(alphamodifiedminimalessentialmedium,GibcoBRL12000-022)6-wellTCplate(or35mmTCdish)methanolglacialaceticacid10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)步骤：1.以a-MEMwith10%FBS(已测试过)培养MDCK细胞于T75flask至80%confluency。2.以trypsin-EDTA处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM稀释细胞浓度为1×102活细胞数/ml。3.将1ml细胞悬浮液接种入6-wellplate中，并另加入1ml含不同浓度的血清(20%,10%,4%,2%,1%,0.4%)之a-MEM，使血清最终浓度为10%,5%,2%,1%,0.5%,0.2%。用已测试过之血清同时进行对照组试验。4.37oC，5%CO2培养箱培养5-7天，期间不需更换培养基，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。5.去除培养基，加入1mlCarnoy’s固定液(甲醇:冰醋酸﹦3:1)，室温下静置10min。6.去除固定液，水洗二次。7.加入1ml10%Giemsasolution，，室温下静置染色2-3min。8.去除染液，水洗二次。9.以肉眼计数群落数10.计算SPE(SerumPlatingEfficiency)：SPE=(no.ofcolonies/