细胞培养细节归纳

细胞培养细节归纳常见问题及其原因分析培养过程的细节复苏分瓶接毒冻存细胞板的使用TCID50测定中的注意点需进一步解决的问题常见问题及其原因分析一污染1细菌污染特点：24h后或分瓶后细胞全部漂浮、培养液浑浊、镜下可见细菌穿梭运动、LB上可长出菌落、打开瓶盖时有味原因：细菌污染一般比较少见，问题一般出在培养基上。（比如配培养基瓶子未干烤、配培养基过滤时滤膜松动。）如果培养液被污染，则未开瓶的培养基在4度放2周后，会出现发黄，细菌沉淀下来，摇动后，浑浊。配培养液时需小心2支原体污染特点：污染初期细胞生长不受影响，后细胞生长变慢。最后细胞完全长不起来。培养液很容易变黄，分瓶10h时就出现培养基发黄。原因：细胞瓶养细胞时少见。板子养细胞时常见。一般在做TCID50、铺板子时觉察不到，但是在做单抗过程中由于要在板子中传代，所以很容易发生。常与操作有关（枪头不是每次新高压、操作时手从板子上过等）。操作时需小心3病毒之间的交叉污染（时刻警惕！！）养成良好的实验习惯和规范操作。比如：洗手、操净台预开15min、开紫外灯等定期用一瓶细胞提DNA检测。进细胞培养的房间需穿房间内的白大褂！二细胞长过头（常见）细胞分瓶时间的把握：由于在细胞瓶中，中间细胞长得比较快，所以要以瓶中间细胞的量为标准，90%时分，不要在意瓶子头和尾部的细胞量。SP2/0细胞尤其要注意：不能以90%为标准，细胞一个连着一个时即需要分，不能等到细胞一个挤一个时分。（视野下细胞一个连着一个时为圆形，一个挤一个时细胞成多边形）。细胞一旦长过头，即弃掉，已失去价值，不必浪费时间。3消化过头和消化不够（很常见）消化过头，传代的细胞内会出现团块，且这种团块随着传代而传代。消化不够，细胞吹不下来，若强行吹，第二天发现细胞漂浮的多了。所以消化时间的把握很重要，需要固定一个适当的消化时间。Dulac为3分钟，PK-15为30秒。PK-15细胞：一次消化细胞瓶少时不会出现消化过的情况，一次操作瓶子过多就会出现。建议：每次消化的细胞瓶不超过6瓶，瓶子量大时，可分多批次进行分瓶操作。（量力而行！）Dulac细胞常消化不够。消化时间掌握非常重要。要固定。如果今天3min，明天4min，则后天3min就失效了！如果消化不够，原瓶就弃了，不必二次消化。一般讲，每次固定消化时间后，不会出现消化不够的情况。4细胞形态变差常常于生长环境有关，因此需要保证细胞瓶的洁净度和培养基批次间的均一性！细胞瓶的处理:弱酸泡5天以上次品瓶子要及时扔了干净的瓶子干烤后,瓶子内应该非常透明和亮,不能有残存细胞印子.培养基批次间的均一性注意：培养液的PH会随着瓶盖打开的次数和培养液暴露在空气间的时间增长而降低，培养液出现紫红色。建议：所养细胞瓶数少时，将培养液用100ml瓶子分装！SP2/0状态好时镜下很少见到漂浮的细胞，但是换培养基后有可能变差。虽然10%DMEM和HT都能养SP2/0细胞，但是一旦两种培养基突然互换，细胞大小会出现明显差异！！细胞分瓶时一对二或三分，不能混合起来最后一起分。长得不好的细胞不参与分瓶，需弃掉。培养过程的细节一复苏1从液氮罐取2支细胞（2支复苏一瓶效果更好），迅速置于37度水浴中，待完全融化之前，迅速插于冰浴中2离心管中加8ml10%DMEM培养液，将细胞缓慢滴加于培养液中，滴加时要一滴一滴地加，由慢到快，需边滴边摇。31000rpm离心10min，倾去培养液（需完全），重加1ml培养液，轻轻吹匀4细胞瓶中预先加3管培养液，将吹匀的细胞缓慢滴加于培养液中，滴加时要一滴一滴，由慢到快，摇匀54-6小时后，倾去原培养液（未贴壁的死细胞较多），PBS洗2次，换新的培养液6注意多观察细胞，细胞长到50%时，需重换一次新培养液。我们在操作中遇到杂交瘤比较难复苏。一支杂交瘤直接复苏至细胞瓶时，一般长不出来；两支杂交瘤一起复苏至细胞瓶时，长势也不好，即使补充饲养细胞效果也不好。因此，我操作时采用在6孔板中复苏（加饲养细胞）的办法！！估计这与杂交瘤冻存前的状态及冻存方法有关！原因可能是：杂交瘤代次低二分瓶1观察细胞瓶中央，视野下细胞长到90%前必须分瓶（在这个情况下，瓶子头部和尾部大约长到了60-70%，不必等到他们长到90%）2PBS洗2次，加胰酶1管，平拿细胞瓶，轻轻摇晃30-40下（保证每晃一下胰酶均与壁上细胞接触），3放培养箱2.5-3min（Dulac细胞）每次时间长短最好固定）后，PBS洗轻轻荡洗2次4轻轻吹下细胞，分装于新瓶中，避免产生泡沫SP2/0细胞分瓶必须非常及时，一个连一个时就要分瓶了，此时培养液为黄红相间色，不要等到培养液明显变黄色。吹细胞要轻，每次换新瓶，7-10天时细胞状态会最好，最好时视野下只见极个别的漂浮细胞。选最好的细胞用来融合。三接毒(针对PCV1-2或PCV2)1细胞中央长到30%（大约在分瓶后10-12小时）前，开始接毒2倾去培养液，洗2次后，加1管无抗无血DMEM后，加病毒液，摇匀3放培养箱30-60min后，加2管10%DMEM和1管无抗无血DMEM（即5%DMEM）4约24h后，细胞可长满80-90%，若病毒需连续传代，可直接分瓶；若想一次收毒，可长到48h？时收毒。48h时细胞基本会长满，瓶子头尾也已长满。能产生细胞病变的病毒，一般72h收毒，在48h后细胞就会开始出现病变；但是不产生细胞病变的病毒，在48h后细胞仍有生长的势头，细胞会越来越挤，越来越小。生长会受到抑制和损伤！四冻存1观察细胞瓶中央，视野下细胞长到70-80%（旺盛期）前必须进行冻存2消化后吹下细胞于10ml离心管，1000rpm离心10min，去上清3细胞沉淀按原1瓶细胞量加0.9ml的培养液重悬，吹匀后，放置冰浴中4按原1瓶细胞量加0.1mlDMSO的比例，将DMSO一滴一滴由慢到快滴于细胞中，边滴边摇（冻细胞不能离开冰浴）5冻存管标好后，装进小布袋，用棉花包好，放-70度冰箱，第3天时转进液氮中。（现用方法，需改进）五细胞板的使用注意点：1先加培养液，再滴加细胞液2四周的细胞孔要多滴加一滴细胞液3细胞液滴加结束后，板子不要摇动4需要做荧光测定的阴性对照孔，与前面的接毒孔，中间有缓冲区5荧光测定过程中，洗板子要悬空加PBS；排枪使用时，同一稀释度的孔用同一个枪头。101102103104105106107108109101102103104105106107108109101102103104105106107108109101102103104105106107108109101102103104105106107108109—101102103104105106107108109—101102103104105106107108109—101102103104105106107108109—12345678910111296孔细胞板排枪六TCID50测定中的注意点1病毒液的梯度稀释病毒液融化后，立即放冰浴上；不同稀释度的枪头不能交叉；稀释后的病毒液加入细胞板时从低浓度到高浓度依次进行2细胞板的固定冷甲醇（或其他）100微升/孔，在4度放10min后，立即排干（可在-20度中保存）3免疫荧光测定一抗、二抗每次作用时是放在37度水浴箱中（湿盒作用）一抗、二抗的量也不是越多越好！50微升30微升需进一步解决的问题一培养液抗生素的浓度细菌污染并不常见。抗生素对SP2/0和杂交瘤细胞有一定影响。有下降空间！二细胞冻存的方法问题：现有保存技术，在复苏细胞时可发现漂浮的不贴壁的死细胞很多处理：包冻存管的棉花中可用无水乙醇浸湿，再放-70度冰箱。更有利于慢冻。三消化方法PK-15细胞很容易消化过头胰酶浓度是否可降低？现在0.05%浓度的，可下降胰酶浓度进行尝试。谢谢！请批评指正！