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技术基因改造专家CRISPR/Cas9技术基本流程基因组编辑（GenomeEditing）步入Cas9的时代专业的CRISPR/Cas9介导的knock-out和knock-in就在南京尧顺禹！南京尧顺禹您的CRISPR/Cas9技术基因编辑专家1南京尧顺禹—CRISPR/Cas9技术专业服务公司一、CRISPR/Cas9技术介导的基因敲除和敲入1、基本原理CRISPR/Cas9靶向基因改造（敲除、敲入）技术是最新发展起来的一种强有力的用于基因组编辑（genomeediting）的分子生物学工具，现已广泛应用于人、大鼠、小鼠、斑马鱼、果蝇、家蚕、线虫、酵母、拟南芥、烟草、高粱、水稻和小麦等各类动植物个体或细胞基因组的遗传学改造。相较于TALEN（TranscriptionActivator-LikeEffectorNuclease）技术，CRISPR技术的效率要高得多，而且采用CRISPR技术可以一次性的对多个基因同时进行基因敲除和/或敲入（Science,2013,15February,p.823）。而先前担心CRISPR/Cas9技术的脱靶问题，最近已有美国马萨诸塞州坎布里奇博大研究所（BroadInstituteinCambridge,Massachusetts）的合成生物学家张丰（FengZhang）通过使用带有点突变的Cas9完全解决（Cell.2013Sep12;154(6):1380-9）。美国哈佛大学的GeorgeChurch认为，CRISPR/Cas9技术的高效率和易用性将是其它已有基因组改造技术包括TALEN等所无法匹敌的（Science.2013Aug23;341(6148):833-6）。CRISPR（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats），即成簇规律间隔的短回文重复序列。Cas9蛋白是一种能够降解DNA分子的核酸酶（nuclease），其中含有两个酶切活性位点，每一个位点负责切割DNA双螺旋中的一条链。CRISPR在大约40%的细菌和90%的古细菌（archaea）的基因组中均有存在，它依赖crRNA(CRISPRRNA能够与tracrRNA配对，形成双链RNA结构，这种双链RNA分子能够介导Cas9核酸内切酶对与双链RNA分技术基因编辑专家2子互补结合的DNA序列进行切割)和tracrRNA(trans-activatingchimericRNA,即反式激活嵌合RNA，一种非编码RNA，能够促进crRNA的形成，是Cas9蛋白发挥RNA介导的DNA切割作用必不可少的辅助因子)对外源DNA进行特异的识别，然后使用Cas9对外源DNA进行序列特异性地切割降解，从在细菌和古细菌细胞发挥了一种获得性免疫的作用。利用这一细菌获得性免疫的工作原理，美国加州大学伯克利分校（UniversityofCalifornia,Berkeley）的生化学家JenniferDoudna研究团队将tracrRNA和空格RNA（spacerRNA）组合起来，形成一个所谓的“向导RNA”分子（single-guideRNA：sgRNA），然后将其与Cas9蛋白混合在一起，成功地对特定的DNA位点进行了切割（Science,17August2012,p.816）。由于sgRNA是通过其中的20核苷酸特异识别目标基因，设计起来非常方便，因此，在这一里程碑式的研究论文发表后，CRISPR技术得到了迅猛的发展。自2013年1月起，大量的有关利用CRISPR技术的文章发表在Science、Nature和Cell上，形成了一个CRISPR热潮。由于CRISPR系统是以RNA作为基因组定位工具，而ZFN（锌指核酸酶）和TALEN核酸酶则都是以人工组装的特异性DNA位点结合蛋白作为基因组定位工具，用ZFN和TAELN技术需要好几个月的实验结果，用CRISPR技术只需要几个星期就可以拿到（Science.2013Aug23;341(6148):833-6）。2、CRISPR/Cas9技术特点：2.1无基因序列、细胞、物种限制；2.2实验设计简单准确、实验周期短、成本低；其中适合于sgRNA识别的目标序列在基因组上广泛特异存在。技术基因编辑专家32.3成功率几乎可达100%；毒性低，使用带点突变的Cas9(D10A)可避免脱靶效应（Cell.2013Sep12;154(6):1380-9）。2.4活性明显高于人工构建的ZFN和TALEN核酸酶活性。2.5克服了常规的ZFN和TALEN方法中制备有活性的人工合成核酸酶较繁琐的确点，更有专业网站辅助设计可特异识别目标基因的gRNA，设计过程非常简单易行。2.6CRISPR/Cas9技术是在DNA水平上进行基因敲除，将暂时性的基因敲降（Knockdown）如RNA干扰（RNAi）和MO敲降等转变成永久性的基因敲除（KnockOut）转变，建立的稳定可传代的基因敲除的细胞系或突变体系可极大地方便研究者的深入研究。2.7融Cas9、sgRNA和报告基因于一个质粒，一个质粒搞定一个基因的修饰。更有报告基因，方便使用荧光显微镜或药物筛选，加速获得基因突变的细胞系。图1、CRISPR/Cas9识别目标基因组DNA(改自Malietal.,2013.Science,339(6121):823-6.)技术基因编辑专家4图2、Cas9（D10A）介导的双切口增强基因组编辑的特异性(引自Ranetal。，2013Sep12;154(6):1380-9)3.CRISPR/Cas9技术应用3.1应用于动植物及微生物基因组水平上的编码基因的靶向基因敲除。细胞内基因组DNA在被CRISPR/Cas9复合体（含Cas9和sgRNA）特异识别后，Cas9核酸内切酶特异切割目标基因组DNA双链，产生DSB（Double-StrandBreaks）损伤，从而诱发DNA损伤修复机制。其中的NHEJ（Non-homologousEndJoining）修复是一种易错修复，在修复过程中会随机引入或删除核苷酸对，导致目标基因内核苷酸对的删除或插入（indel），从而形成移码突变，造成目标基因的突变，实现基因敲除。而如果在编码基因的目标外显子的5’侧翼和3’侧翼分别设计一个sgRNA，则可以实现删除目标基因内片段式的基因敲除。3.2应用于动植物基因组水平上的非编码基因如lncRNA（longnon-codingRNA）和microRNA的靶向基因敲除。通过在非microRNA前体的发夹结构5’侧翼和3’侧翼游处分别设计一个sgRNA，可以删除发夹DNA结构片段，从而实现对microRNA的敲除。而如果microRNA成熟片段内含有sgRNA识别序列，则可以直接实现删除或插入式（indel）的基因敲除。同样地，运用CRISPR/Cas9技术基因编辑专家5技术可以实现对lncRNA等的基因敲除。3.3应用于动植物及微生物基因组水平上的编码基因的靶向基因敲入。Cas9切割目标基因DNA双链产生DSB（Double-StrandBreaks）损伤还诱发细胞启动同源重组修复（homologousrepair:HR）。此时，若能提供同源修复模板供体（donor），而此供体亦已引入如点突变、保守区域替换、或加入标签编码序列（如GFP、Flag、HA....）等，则研究者可实现在基因组特定位置的基因敲入。3.4多基因同时敲除。由于CRISPR系统是以RNA作为基因组定位工具，因此将一份Cas9和多个针对不同目标基因的sgRNA表达元件同时转入细胞或胚胎，就可轻松实现多个基因的一次性的同时敲除。3.5应用于动植物基因组水平上目标基因的表达激活和表达抑制。Cas9含有两个酶切活性位点，每一个位点负责切割DNA双螺旋中的一条链。如果把两个活性位点均突变掉，则该Cas9不在具备核酸内切酶活性，不过，它仍能通过sgRNA结合在目标基因的启动子上。如果在双突变的Cas9（dCas9）的C端加上VP16等具激活活性的功能结构域，则可以特异地激活目标基因的表达。如果在双突变的Cas9（dCas9）的C端加上EVE等抑制活性的功能结构域，则可以特异地抑制目标基因的表达（Cell.2013Jul18;154(2):442-51）。3.6应用于动植物基因组水平上目标基因的甲基化、去甲基化等表观修饰。如果在双突变的Cas9（dCas9）的C端加上甲基化酶或去甲基化酶技术基因编辑专家6等，则可实现对目标基因的表观修饰。二、本公司的CRISPR/Cas9技术优势南京尧顺禹研发人员紧跟CRISPR/Cas9技术的进步，研发出了可适合客户不同需求的质粒骨架，在国际上首次构建了多种选择标记的Cas9质粒，仅需4天时间就可以构建出正确的含表达客户特异sgRNA的Cas9质粒载体，更有多种报告基因可供客户选择，大大加速了客户获得突变细胞系的速度。具体步骤可简述为：1）第一天进行目标基因特异gRNA的设计，根据设计合成一对目标基因特异的Oligos。第二天获得Oligo后，与骨架质粒进行连接和转化。第三天挑克隆进行PCR验证，同时送测，第四天可得到测序正确的质粒，同时进行质粒抽提。南京尧顺禹拥有强大的技术支持团体，与国内外众多科研院所合作紧密。目前已为包括：美国宾西法利亚大学、Temple大学、台湾中研院、香港大学、台湾中原大学、复旦大学、南京大学、南京农业大学、南京医科大学、广东珠江水产所等多个国内外单位提供服务。涉及的物种包括人、小鼠、大鼠、斑马鱼、黄颡鱼、猪、羊、鸡、牛等。利用南京尧顺禹提供的Cas9系统，相关单位已建立了多个基因敲除的斑马鱼突变品系以及人和小鼠等动物的细胞系。技术基因编辑专家7三、CRISPR/Cas9技术介导基因敲除详细说明1、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的一般流程：1.1确定待敲除基因的靶位点1.2设计识别靶位点的识别的一对DNAOligo（引物）1.3构建可表达sgRNA的Cas9质粒1.4含sgRNA表达元件的Cas9质粒的活性检测1.5利用Cas9质粒建立knock-out细胞系2、利用Cas9质粒建立knock-out细胞系实验的详细过程：2.1确定待敲除基因的靶位点根据提供的物种、基因名称或者基因ID在NCBI或ENSEMBLE中进行查找。找到该基因CDS区，分析相应的基因组结构，明确CDS的外显子部分。按照基因本身的性质，选择候选的待敲除位点，确定待敲除位点。对于蛋白编码基因，如果该蛋白具重要结构功能域，可考虑将基因敲除位点设计在编码该该结构域的外显子；如果不能确定基因产物性质，可选择将待敲除位点放在起始密码子ATG后的外显子上。如果是microRNA，可以将待敲除位点设计在编码成熟microRNA的外显著子或在编码成熟microRNA的外显著子的5’和3’侧翼序列。耗时1-4小时。2.2设计识别靶位点的识别的一对DNAOligos确定待敲除位点后，选择23-至250bp的外显著子序列输入到在线的免费设计gRNA的软件Input框中，然后进行设计运算，软件会自动