第六章 核酶和抗体酶

退出EnzymeEngineering酶工程退出第五章核酶和抗体酶第一节ribozyme第二节脱氧核酶第三节抗体酶退出第一节ribozyme一、ribozyme的发现二．Ribozyme的种类三．Ribozyme研究进展与展望退出自然界选择催化分子的特点一、组成的元件比较丰富，利于针对不同的反应形成特定的复杂空间结构。二．具有多种活性基团三．能够遗传和变异退出符合催化剂的条件一、在体外条件下能单独催化别的分子的反应二．少量的催化剂就能使反应大大加速三．催化剂在反应前后不改变退出一、ribozyme的发现80年代初期，美国科罗拉多大学博尔德分校的ThomasCech和美国耶鲁大学的SidneryAltan各自独立地发现RNA具有生物催化功能.从而改变了生物催比剂的传统概念。为此，T.Cech和S.Altman共同获得了1989年度诺贝尔化学奖。退出二．Ribozyme的种类自然界存在催化分子内反应（incis）的ribozyme(自我剪接型和自我剪切型)和催化分子间反应(intrans)的ribozyme。退出一．自我剪接ribozyme简介自我剪接ribozyme比较复杂，通常包括200个以上核苷酸，主要催化mRNA前体的评接反应。四膜虫核糖体前体RNA可以在体外无蛋白质参与下除掉它自身413nt内含子。具有核酸内切酶和连接酶活性。退出二．自我剪接ribozyme分类自我剪接ribozyme可分为两类：Ⅰ型IVS：均与四膜虫大核rRNA前体的IVS结构相似、催化自我剪接需鸟苷（或5′鸟苷酸）和Mg2+参与。Ⅱ型IVS：结构与四膜虫的不同，而与细胞核mRNA前体中的IVS相似。它催化自我剪接反应不需要鸟苷或鸟苷酸参与，但仍需Mg2+退出三．自我剪切ribozyme的分类自我剪切ribozyme,自我剪切的RNA结构有锤头结构和发夹结构，其中尖头指出自我剪切的部位。自我剪接ribozyme：包含剪切与连接两个步骤。相当于核酸内切酶退出几种能进行自我剪切的RNA结构退出锤头型核酶退出锤头型核酶作用机制退出发夹型核酶退出3．催化分子间反应的ribozyme的分类如：L-19IVS具有5种酶活性，可催化多种分子间反应。核苷酸转移酶、磷酸二酯酶、磷酸转移酶、聚合酶、催化自身环化退出三．Ribozyme研究进展与展望对各种已知ribozyme结构与功能关系的研究。可找出其结构功能域和必需基团，据此可进行分子改造，以获得分子更小的、高效的ribozyme退出退出研究热点：从催化分子内反应的自我剪切ribozyme设计出催化分子间反应的ribozyme.例如：锤头结构，它由两部分组成，一部分是设计的ribozyme,另一部分是其底物。根据它们在锤头结构中的相对位置，可分为四种类型。其中以（d）类型应用最广，即一个线状RNA分子可被一个具有催化中心，同时两侧与底物RNA分别互补的ribozyme特异降解。点击看图退出热点二：蛋白质-RNA复合酶例：大肠杆菌tRNA5’成熟酶，由蛋白质和M1RNA两个组分构成，其中蛋白质的分子质量为20Ku，M1RNA含有377个核苷酸，具有全酶活性，蛋白质只是维护其构象。该酶也是一种剪切核酶，产物3’端是羟基，5’端是磷酸退出Ribozyme的固定化Ribozyme的固定化已成功，将在医学、工业上获得应用。退出应用1将Ribozyme基因构建于特定载体上，在爪蟾卵母细胞、Hela细胞等已表达成功，产生的ribozyme能阻断特定基因（如氯霉素酰基转移酶基因等）的表达。退出应用2根据锤头结构或发夹结构原理设计的ribozyme基因导入已获得美国FDA批准，很快将在临床上使用。退出应用3一种高效并准确释放ribozyme的质粒已构建，它将推动ribozyme的研究。退出意义：对各种RNA-蛋白质复合物酶的分离鉴定，对许多具有特别重要生物功能的RNA和蛋白质构成的颗粒体。在自然界将会发现更多的具有自我剪接或自我剪切的RNA分子和以非RNA为底物的ribozyme。退出意义：通对它们的结构与作用机制的研究，可设计出更多的高效、稳定的ribozyme。这些ribozyme可能成为研究RNA结构的有用工具，可能成为体内阻断有害基因表达和抗病毒感染、抗肿瘤的有效药物。导入抗病ribozyme基因的转基因生物的出现将为期不远。退出第一节结束Ribozyme的发现Ribozyme的种类Ribozyme研究进展与展望T.Cech和S.Altman分子内（incis）的ribozyme(自我剪接型和自我剪切型)分子间(intrans)的ribozyme退出第一节结束点击返回退出第二节脱氧核酶一．概念具有酶活性的DNA分子称为脱氧核酶二关键设计思路与RNA酶类似，不同的是不需要转录和逆转录，进行PCR扩增时，需要单链DNA分子进入下一轮筛选。三对策正链引物上连接生物素，PCR产物经过抗生素蛋白亲和柱达到正链与负链分离。退出脱氧核酶的结构Carmi等通过体外选择技术合成了一种依赖Ca2+的具有自我切割功能的手枪型二级结构脱氧核酶分子退出三．脱氧核酶的催化特性1．效率高2．高度专一性3．活性依赖金属离子4．其它辅助因子退出1．效率高以Kcat/Km表示，脱氧核酶的催化效率在109mol.min-1左右，超过任何其他的核酶。脱氧核酶的催化效率决定于底物结合速率退出2．高度专一性这种专一性是酶-底物以Watson-Crick碱基配对形成二联体或三联体的识别方式所决定。结合部位或催化部位的个别碱基突变导致碱基不配对，酶活将会丧失；碱基位置互换，仍是配对，则活性恢复。酶底物的结合亲和力决定于识别部位的序列长度短，最佳序列长度在14-20核苷酸范围内。退出3．活性依赖金属离子Mg2+、Zn2+、Cu2+、Pb2+、Ca2+、Mn2+、三价的镧族离子最高能提高酶活力105倍退出4．其它辅助因子氨基酸（组氨酸）、精胺，该酶的螺旋结构与酶活性的关系也与锤头状核酶相似。脱氧核酶、核酶、蛋白酶在某种程度上有相似的切割催化机制加入额外功能基团以扩增它们结构和功能的多样性退出四．酶促反应动力学特征1．PH值和温度对酶反应速率的影响2．激活剂3．酶浓度对酶反应速率的影响退出1．PH值和温度对酶反应速率的影响pH4-8范围内呈钟形，在pH6.2左右达最大值。最适温度在40℃左右。退出2．激活剂K+、Na+、Mg2+、Mn2+、Pb2+等；阴离子如组氨酸，还有H+等。表明酶的折叠活性形式中可能有G-四联体存在。退出3．酶浓度对酶反应速率的影响在底物过量和其他参数不变的条件下，催化速率与酶浓度成比例关系，符合米氏方程。V与[E]成直线关系退出五．生物学意义三种脱氧核酶的活性：连接酶活性金属螯合酶活性（催化卟啉环反应Cu2+Zn2+)激酶活性切割RNA的脱氧核酶（能在RNA的A.U位点切割）切割DNA的脱氧核酶退出第二节结束概念结构催化特性反应动力学特征生物学意义效率高高度专一性活性依赖金属离子辅助因子PH值和温度对酶反应速率的影响激活剂酶浓度对酶反应速率的影响连接酶活性金属螯合酶活性磷酸酯酶活性退出第二节结束点击返回退出第三节抗体酶酶与抗体的共同点酶与抗体的不同点都是具有高度特异结合能力的蛋白质十分相似的方式与各自对应的配体（底物或抗原）结合生物功能不同酶与底物以过渡态结合而抗体和抗原在基态结合退出第三节抗体酶二抗体的优势1原始大家族有1*108结合部位，体细胞变异还可以增加1*104结合部位2抗体与抗原结合面积700平方埃，结合小分子半抗原也在600平方埃，胰蛋白酶与其抑制剂所占300平方埃3抗体的精细识别性使其能结合几乎任何天然或人工合成的分子4高亲和性，解离常数在1*10-4到1*10-14退出第三节抗体酶三Abzyme的首次发现羧酸二酯水解反应的过渡态类似物硝基苯酚磷酸胆碱酯-以次作为半抗原诱导产生单克隆抗体-艰苦筛选-两株具有催化活性的单抗-可以加快水解反应速度1.2*104与9.2*103，催化反应符合米氏方程，底物专一性及pH、温度依赖性，还初步确定参与反应的氨基酸残基。具有抗原结合位点的Fab段单独就具有与全酶一样的催化效率退出第三节抗体酶四.概念是一种具有催化功能的抗体分子，在其可变区赋予了酶的属性。是抗体的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。退出五.抗体酶概述已成功开发出天然酶所催化的6种酶促反应和数十种类型的常规反应的抗体酶：酯、羧酸和酰胺键的水解，酰胺键的水解，酰胺形成，光诱导裂解和聚合，酯交换，内酯化等。退出三.抗体酶的催化反应1．酰基转移反应退出2．重排反应退出3．氧化还原反应退出4．金属螯和合反应退出5．磷酸酯水解反应退出6．磷酸酯闭环反应退出7.光诱导反应a.光聚合反应（二聚作用）退出b.光裂解反应退出六.制备方法i.诱导法：即用设计好的半抗原，通过间隔链与载体蛋白（例如牛血清白蛋白等）偶联制成抗原，然后采用标准的单克隆抗体来制备、分离、筛选抗体酶。半抗原设计原则就是酶的催化作用机制。常用过渡态类似物半抗原。退出利用过渡肽类似物制备抗体示意图退出ii.引入法将催化基团或辅助因子引入到抗体的抗原结合部位，可采用选择性化学修饰方法，亦可利用蛋白质工程和基因工程技术退出引入法例美国使用可裂解亲和标记物将含巯基的柄状亲核基团引入到抗2，4-二硝基苯酚（DNP）的单抗的抗原结合位点，得到的抗体酶对含有(DNP)与香豆素的羧酸酯的水解反应的催化效率比二硫苏糖醇高6*104倍。退出引入法不仅是这个含巯基的亲核基团能加速反应，而且是它作为一个诱导物可引入各种催化基团和辅助因子。还将荧光素联结在这个柄上，当抗原插入到抗体结合部位时，荧光迅速减弱，可检测荧光强度来研究抗体抗原的结合反应。退出引入法举例退出iii.拷贝法用酶作为抗原免疫动物得到抗酶的抗体，再将此抗体免疫动物并进行单克隆化，获得单克隆的抗抗体。对抗抗体进行筛选，应获得具有原来酶活性的抗体酶。缺点：具有一定的盲目性和偶然性，并且不能产生新酶。退出拷贝法示意退出七．Abzyme应用1．有机合成中的应用基础：任何分子，几乎都可以通过免疫系统产生相应的抗体，而且专一性很强。生产需要精确底物专一性和立体专一性，特别是天然酶不能催化的反应，可以设计可以催化不利的反应过程，对于动力学控制的几个反应产物来说，可以通过稳定其中的一个过渡态，来显著改变反应产物的比例。退出七．Abzyme应用2.用于阐明化学反应机制例：N-甲基原卟啉由于内部甲基取代而呈扭曲结构，由它作为半抗原诱导产生的抗体可催化原卟啉的金属螯合反应，证明亚铁螯合酶催化亚铁离子插入原卟啉的反应过渡态是一个原卟啉的扭曲结构，平面结构的原卟啉经扭曲后，才能螯合金属离子。退出七．Abzyme应用3在医药上的应用基础：既能标记抗原靶目标，又能执行一定的催化功能，使其在体内应用实际是没有限制的。例如：可以设计抗体酶杀死特殊的病原体，也可用抗体酶活化处于靶部位的药物前体，以降低药物毒性，增加其在体内的稳定性。退出第三节结束抗体酶的催化反应制备方法酰基转移反应重排反应氧化还原反应金属螯和合反应磷酸酯水解反应磷酸酯闭环反应光诱导反应a.光聚合反应（二聚作用）b.光裂解反应诱导法引入法拷贝法退出第三节结束点击返回