相衬显微镜

相差显微镜（phasecontrastmicroscope）又称相衬显微镜。在光学显微镜的改进过程中，相衬显微镜的制造成功和普遍的应用，是近代显微镜技术中的重要成就。在1935年荷兰学者泽尼克（P.Zernike）提出了相衬法原理，至1941年由德国蔡司工厂诞生了世界上第一台相衬显微镜。它的产生，使人类的视觉在光学显微镜下又得到新的扩展。从信息利用的角度来看，人们将它视为光学信息处理概念下的第一个产品，因而获得了1953年诺贝尔物理学奖。我们知道，人眼只能在光波的波长（颜色）和振幅（亮度）有变化的情况下，才能在显微镜下看到被检物体的存在，但活的生物体多是无色透明的，当光线通过时，波长和振幅变化不显著，这样在明场镜检下就难于观察清晰。为了克服这一困难，可以采用一定的措施，如物理、化学处理法、材料经固定、染色等过程，使被检物体的颜色及亮度发生变化，但这只能观察已被杀死的材料，而不能观察到活体状态；当然，缩小聚光镜的孔径光阑，以增加明暗反差的对比，但这样不能充分发挥物镜数值孔径的性能，细微结构仍难于被分辨，同时镜象亮度也随之降低；利用暗场、荧光或偏光镜检术，虽然能观察活体标本，但这些显微术都是利用不同的光学原理，达到特定的观察目的，镜检效果局限在一定范围内。可见上述措施都不能得到满意的镜检效果，而采用相衬显微术，则能解决上述问题，使无色透明活体标本的细微结构在相衬显微镜下变得清晰可见。这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。一、相差显微镜的特点相差显微镜是一种将光线通过透明标本细节时所产生的光程差（即相位差）转化为光强差的特种显微镜。光线通过比较透明的标本时，光的波长（颜色）和振幅（亮度）都没有明显的变化。因此，用普通光学显微镜观察未经染色的标本（如活的细胞）时，其形态和内部结构往往难以分辨。然而，由于细胞各部分的折射率和厚度的不同，光线通过这种标本时，直射光和衍射光的光程就会有差别。随着光程的增加或减少，加快或落后的光波的相位会发生改变（产生相位差）。光的相位差人的肉眼感觉不到，但相差显微镜能通过其特殊装置--环状光阑和相板，利用光的干涉现象，将光的相位差转变为人眼可以察觉的振幅差（明暗差），从而使原来透明的物体表现出明显的明暗差异，对比度增强，使我们能比较清楚的观察到普通光学显微镜和暗视野显微镜下都看不到或看不清的活细胞及细胞内的某些细微结构。二、相差显微镜的成像原理镜检时光源只能通过环状光阑的透明环，经聚光器后聚成光束，这束光线通过被检物体时，因各部分的光程不同，光线发生不同程度的偏斜（衍射）。由于透明圆环所成的像恰好落在物镜后焦点平面和相板上的共轭面重合。因此，未发生偏斜的直射光便通过共轭面，而发生偏斜的衍射光则经补偿面通过。由于相板上的共轭面和补偿面的性质不同，它们分别将通过这两部分的光线产生一定的相位差和强度的减弱，两组光线再经后透镜的会聚，又复在同一光路上行进，而使直射光和衍射光产生光的干涉，变相位差为振幅差。这样在相差显微镜镜检时，通过无色透明体的光线使人眼不可分辨的相位差转化为人眼可以分辨的振幅差（明暗差）。三、相差显微镜的结构和装置相差显微镜与普通光学显微镜的基本结构是相同的，所不同的是它具有四部分特殊结构：即环状光阑、相板、合轴调节望远镜及绿色滤光片。相差显微镜照明原理1.环形光阑（annulardiaphragm）位于光源与聚光镜之间，作用是使透过聚光镜的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。光阑的直径大小是与物镜的放大倍数相匹配的，并有一个明视场光阑，与聚焦镜一起组成转盘聚光镜。在使用时只要把相应的光阑转到光路即可。2.相位板（annularphaseplate）位于物镜内部的后焦平面上。相板上有两个区域，直射光通过的部分叫“共轭面”，衍射光通过的部分叫“补偿面”。带有相板的物镜叫相差物镜，常以“Ph”字样标在物镜外壳上。相板上镀有两种不同的金属膜：吸收膜和相位膜。吸收膜常为铬、银等金属在真空中蒸发而镀成的薄膜，它能把通过的光线吸收掉60%-93%，相位膜为氟化镁等在真空中蒸发镀成，它能把通过的光线相位推迟1/4波长。根据需要，两种膜有不同的镀法，从而制造出不同类型的相差物镜。如果吸收膜和相位膜都镀在相反的共轭面上，通过共轭面的直射光不但振幅减弱，而且相位也被推迟1/4λ，衍射光因通过物体时相位也被推迟1/4λ，这样就使得直射光与衍射光维持在同一个相位上。根据相长干涉原理，合成光等于直射光与衍射光振幅之和，因背景只有直射光的照明，所以通过被检物体的合成光就比背景明亮。这样的效果叫负相差，镜检效果是暗中之明。如果吸收膜镀在共轭面，相位膜镀在补偿面上，直射光仅被吸收，振幅减少，但相位未被推迟，而通过补偿面的衍射光的相位，则被推迟了两个1/4λ，因此衍射光的相位要比直射光相位落后1/2λ。根据相消干涉原理，这样通过被检物体的合成光要比背景暗，这种效果叫正相差，即镜检效果是明中之暗。负相差物镜（Negativecontrast）用缩写字母“N”表示，正相差物镜（Positivecontrast）用缩写字母“P”表示，由于吸收膜对通过它的光线的透过率不同，可分为高、中、低及低低，如Olympus光的透过率分为：7%、15%、20%、40%四个等级，因此分为高（High略写为H），中（Medium略写为M），低（Low略写为L）及低低（Low-Low略写成LL）四类，构成了负高（NH）、负中（NM）、正低（PL）和正低低（PLL）四种类型相差物镜，这些字母符号都写在相差物镜的外壳上。可根据被检物体的特性来选择使用不同类型的相差物镜。3.合轴调节望远镜是相差显微镜一个极为重要的结构。环状光阑的像必须与相板共轭面完全吻合，才能实现对直射光和衍射光的特殊处理。否则应被吸收的直射光被泄掉，而不该吸收的衍射光反被吸收，应推迟的相位有的不能被推迟，这样就不能达到相差镜检的效果。由于环状光阑是通过转盘聚光器与物镜相匹配的，因而环状光阑与相板常不同轴。为此，相差显微镜配备有一个合轴调节望远镜（在镜的外壳上标有“CT”符号），用于合轴调节。使用时拨去一侧目镜，插入合轴调节望远镜，旋转合轴调节望远镜的焦点，便能清楚看到一明一暗两个圆环。再转动聚光器上的环状光阑的两个调节钮，使明亮的环状光阑圆环与暗的相板上共轭面暗环完全重叠。如明亮的光环过小或过大，可调节聚光器的升降旋钮，使两环完全吻合。如果聚光器已升到最高点或降到最低点而仍不能矫正，说明玻片太厚了，应更换。调好后取下望远镜，换上目镜即可进行镜检观察。4.绿色滤光片由于使用的照明光线的波长不同，常引起相位的变化，为了获得良好的相差效果，相差显微镜要求使用波长范围比较窄的单色光，通常是用绿色滤光片来调整光源的波长。Olympus厂家生产的相差显微镜在镜检时要使用该厂规定的IF550绿色滤光片作为配套器件。四、相差显微镜的使用范围、操作步骤及注意事项1.使用范围相差显微镜能观察到透明样品的细节，适用于对活体细胞生活状态下的生长、运动、增殖情况及细微结构的观察。因此，是微生物学、细胞生物学、细胞和组织培养、细胞工程、杂交瘤技术等现代生物学研究的必备工具。2.操作步骤（1）根据观察标本的性质及要求，挑选适合的相差物镜。（2）将标本片放到载物台上。（3）进行光轴中心的调整。（4）取下一侧目镜，换上合轴调节望远镜，调整环状光阑与相板上的共轭面圆环完全重叠吻合，然后取下合轴调节望远镜，换回目镜。在使用中，如需要更换物镜倍数时，必须重新进行环状光阑与相板共轭面圆环吻合的调整。（5）放上绿色滤光片，即可进行镜检，镜检操作与普通光学显微镜方法相同。3.注意事项（1）视场光阑与聚光器的孔径光阑必须全部开大，而且光源要强。因环状光阑遮掉大部分光，物镜相板上共轭面又吸收大部分光。（2）不同型号的光学部件不能互换使用。（3）载玻片、盖玻片的厚度应遵循标准，不能过薄或过厚。