第三章 高效液相色谱法

第三章高效液相色谱法(HPLC)高效液相色谱法：特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。高压：150-350*105Pa高效：大于30000塔板/米高灵敏：10-9g（紫外检测）、10-11g（荧光检测）§3-1高效液相色谱法的特点高效液相色谱法与经典液相色谱法经典液相柱色谱装置高效液相色谱仪经典液相色谱HPLC固定相粒径流动相驱动方式流动相流速150-200μm重力或低压泵很慢3-10μm高压泵快(1-10mL/min)例：分离20种氨基酸柱长：170cm柱径：0.9cmF：30mL/ht分离:20h经典柱色谱HPLCt分离：1h一、HPLC与GC对比1．分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测占有机物的20%HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛，占有机物的80%2．流动相区别GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。3．操作条件区别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）二、HPLC的特点和实际应用1、利用其高柱效（n=104片/米），有效分离极复杂体系中的痕量组分。2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨基酸、常见阴阳离子等）3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分离高分子化合物。4、利用手性固定相可以拆分分离具有手性的化合物。§3-2基本理论和条件选择一色谱柱柱效的基本关系式222/1'16'54.5WtWtnrreffeffeffnLH二分离度14)()(22112effrrnWWttR三速率方程CuuBAHMDB20uB在大多数情况下，溶质在液相流动相中的扩散系数，约为气相中扩散系数的万分之一2）涡流扩散项及其影响（忽略纵向扩散项后）：uCAHHPLCmDB2TDm相忽略大低，流动相柱温BTRtnHuuHscmu，但柱效，时，/1min/1mlu选择兼顾柱效和分析时间，讨论：1）流动相流速对HPLC板高的影响（与GC对比）dpA2dpA柱效，，nHAdp3）传质阻力项及其影响ssmmCCCCuCuCAHHPLCsmm：msmmDdpCC2mDdpC2TDm柱效，nHCdp柱效，nHDm，柱阻，，但易产生气泡mmDTCDT粘度CuAH流动相流速对板高的影响1)小颗粒填料，填充均匀；2)选择较低的流动相流速；3)选择粘度小的溶剂作流动相，改善传质。修正的速率方程：提高柱效途径1．22114kknRuCAH流动相采用粘度小、低流速的匀的固定相：采用粒度小、填充均n''''12121212RRRRVVttkkKK温影响小）质和固定相性质（受柱：调整流动相种类、性0'ttVVKVCVCWWkRmsmmssms小）的配比（受柱温影响较：调整流动相和固定相k四、影响分离的因素柱效项柱选择项容量因子项1.固定相与装柱方法的选择：选粒径小的、分布均匀的球形固定相dp≤10μm）,首选化学键合相，匀浆法装柱2.流动相及其流速的选择：选粘度小、低流速的流动相——甲醇，约1ml/min3.柱温的选择：选室温250C左右五、HPLC法中分离条件的选择一、液固吸附色谱法（LSC）(liquid-solidadsorptionchromatography)二、液液分配色谱法（LLC）(liquid-liquidpartitionchromatography,chemicalbondedphasechromatography三、离子色谱法（IC）（ion-exchangechromatographyandionpairchromatography)四、空间排阻色谱法（SEC）（stericexclusionchromatography§3-3高效液相色谱法的主要类型1．分离机制：利用溶质分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异分离前提：K不等或k不等一、液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂2固定相硅胶－强极性氧化铝－弱极性活性炭－非极性分子筛－强极性高分子多孔微球(GDX)固体吸附剂固定相：固定相粒径（10μm）（2）高分子多孔小球：YSG原理：吸附+分配蒹小孔凝胶作用特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物（1）硅胶表孔硅胶（薄壳硅胶）全多孔硅胶无定形YWG5~6μm5×104球形YQG3~4μm8×108堆积硅珠YQG3~4μm8×108理想原理：吸附特点：峰易拖尾适用：分离极性化合物3流动相(洗脱剂)越大，表明流动相溶剂分子对吸附剂的亲和能力越强，则越易从吸附剂上将被吸附的溶质洗脱下来。。溶剂分子在单位吸附剂表面上的吸附自由能。溶剂强度参数硅胶固定相分离苯，甲苯，乙苯，丙苯，丁苯流动相：干燥正庚烷1份水饱和的正庚烷2份干燥正庚烷水饱和的正庚烷改变流动相的组成可改变分离的选择性4竞争吸附平衡Xm+nSa=Xa+nSmX溶质分子S溶剂分子如果溶剂分子吸附性更强，则被吸附的溶质分子就少。分配系数大的组分，吸附剂对它的吸附能力强，保留值就大。5应用具有不同官能团的化合物具有相同官能团，但数量不同的化合物异构体例：几种取代位置不同的硝基苯胺的分离。在硅胶吸附剂上的滞留顺序：邻位间位对位邻硝基苯胺间硝基苯胺对硝基苯胺适合分离的物质1．分离机制：利用组分在两相中溶解度的差异二、液液分配色谱法（LLC）msccKK不仅与固定相的种类有关，也与流动相的种类有关2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点：系统内部压力大，易流失，不实用固定液——极性→NLLC固定液——非极性→RLLC3．正相色谱——固定液极性流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱适于分离极性组分反相色谱——固定液极性流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分固定相极性流动相极性正相分配色谱组分极性越大，保留时间越长反相分配色谱固定相极性流动相极性组分极性越小，保留时间越长（一）常规化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）2．特点：不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱4、化学键合固定相（二）正相键合相色谱1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向作用力、诱导力、或氢键作用力2．固定相：极性大的氰基或氨基键合相3．流动相：极性小（同LSC）底剂+有机极性调节剂例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，组分tR↓，k↓5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱,极性大的组分后出柱（三）反相键合相固定相1．分离机制：疏溶剂理论2．固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（ODS柱——HPLC约80%问题）3．流动相：极性大的甲醇-水或乙腈-水流动相极性固定相极性底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水+甲醇，乙腈，THF4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑5．出柱顺序：极性大的组分先出柱,极性小的组分后出柱三离子交换色谱法阳离子交换阴离子交换++RSO3-H+H+RSO3-M+M+RNR3+Cl-+X-RNR3++X-Cl-1分离原理离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有同电荷的溶质离子进行可逆交换,依据这些离子对交换剂具有不同的亲合力而将它们分离。2固定相阳离子：－SO3H(强)－CO2H(弱)阴离子：－N+R3(强)－NH2(弱)基质合成树脂纤维素硅胶离子交换剂3流动相水相缓冲液+有机改性剂调节选择性的主要参数盐种类及浓度pH值各种阴离子在阴离子交换剂上的滞留次序：FOHCOOCHHCOOClSCNBrCrONOIOCSO324324224柠檬酸离子用柠檬酸离子洗脱比用氟离子洗脱快4应用离子及可离解的化合物如稀土化合物及各种裂变产物，氨基酸、核酸、蛋白质等四空间排阻(凝胶)色谱法排阻色谱分离示意图按照溶质分子大小分离，相对分子质量差别大于10％的化合物才可以分离1分离原理2固定相是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体，其中含有大量液体（一般是水），柔软而富于弹性。凝胶3流动相洗脱体积是试样组分相对分子质量的函数，洗脱次序将决定于相对分子质量的大小，试样峰全部在溶剂的保留时间前出峰。§3-4高效液相色谱仪液相色谱高压泵流动相溶剂废液色谱柱进样口检测器一高压输液系统1高压泵要求输出压力高平稳、脉冲小流量稳定可调耐腐蚀2梯度洗脱装置低压梯度高压梯度通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。梯度洗脱等度洗脱与梯度洗脱梯度洗脱的特点改善分离,加快分析速度；改善峰形,减少拖尾;可能引起基线漂移分配比变化范围宽的复杂样品应采取梯度洗脱方式分离3贮液瓶及流动相1)对样品有一定的溶解度，以防在柱头产生沉淀。2)适用于所选择的检测器。3)化学惰性好，以免破坏固定相。4)低粘度，增加样品的扩散系数，提高柱效。5)纯度高。溶剂不纯会增加检测器噪声，产生伪峰。对流动相溶剂的一般要求二进样系统准备状态进样状态六通阀进样装置自动进样器三色谱柱内径：1～6mm，柱长：5～30cm；柱填料粒径：5µm分离柱四检测系统1紫外吸收检测器(a)可变波长紫外检测器(b)二极管阵列检测器氘灯流通池测量光电二极管参比光电二极管2二极管阵列检测器两种检测器的色谱图(a)：可变波长紫外检测器；(b)：二极管阵列检测器(b)(a)nm254紫外检测器灵敏度高，精密度及线性范围较好，可用于梯度洗脱。流动相选择有限制。一些常用溶剂的紫外截止波长溶剂CS2氯仿四氢呋喃苯乙睛甲醇水紫外截止波长/nm3802452122101902051873荧光检测器灵敏度高，选择性好，可用于梯度洗脱。4示差折光检测器利用组分与流动相的折射率之差进行检测。通用性好，灵敏度较低，不适用于梯度洗脱。5化学发光检测器6电化学检测器①电导检测器②安培检测器7质谱检测器§3-5高效液相色谱分离类型的选择毛细管固相微萃取－液相色谱法测定水中的多环芳烃仪器设备•高效液相色谱HP21050(美国惠普公司),包括Rheodyne7125进样阀(20μL),四元溶剂泵,紫外检测器。色谱柱为HewlettPackardODShypersil(5μm,200mm×4.6mm)。•色谱条件:流动相为乙腈∶水=90∶10(V∶V),流速0.6mLPmin。根据各待测物质的保留时间将检测器波长按时间程序设置为各物质相应的最大吸收波长(蒽:λ=240nm;荧蒽:λ=236nm;1,22苯并蒽:λ=287nm)。•进样器(25μL,500μL)购于美国Hamilton公司,其针管部分可拆卸更换。进样器泵(美国HarvardApparatus公司)用于控制进样器排出水样的速度。§3-6高效液相色谱应用实例