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【S】GPH1-1生物制品质量控制分析方法验证技术审评一般原则药品审评中心2005年12月目录一、概述…………………………………………………………..2二、生物学测定常用方法...……………………………………….3三、方法的来源（种类）…………………………………………4四、分析方法………………………………………………………5五、分析方法的验证……………………………………………....7（一）专属性（二）准确性（三）精密度（四）线性（五）范围（六）耐用性（七）检测限度（八）定量限度六、综合分析……………………………………………………...13七、名词解释……………………………………………………...13八、参考文献……………………………………………………..14九、附录（推荐的验证方案）…………………………………..15十、起草说明……………………………………………………..16十一、著者……………………………………………………..211一、概述质控分析方法验证就是证明采用的方法适合于相应检测要求，具有相当的准确性和可靠性，进而可以达到控制产品质量的目的。只有经过验证的分析方法才能用于控制产品质量，因此方法验证是制定质量标准的基础。一般情况下，需验证的分析项目有：鉴别试验、杂质检查、原液或制剂中有效成分的含量测定及生物活性测定。其它质控方法，如必要时也应加以验证。生物制品质控中采用的方法包括理化分析方法和生物学测定方法。生物制品的理化分析方法验证原则与化学药品基本相同，可参照《化学药物质量控制分析方法验证技术指导原则》进行，同时需结合生物制品的特点考虑。本技术审评一般原则主要针对生物学测定方法的验证进行讨论。生物学测定方法可广泛用于各种检测目的，包括鉴别、生物活性和杂质检测等，其中最主要的是生物活性（或效价、效力）测定。相对于理化分析方法而言，生物学测定具有更大的可变性，一般要使用动物、细胞或生物分子，因此对于生物学测定的判断标准可适当灵活掌握，但是对于定量测定方法应尽可能减少方法的变异，验证的结果仍应能证明该方法具有相当的准确性和可靠性，并应以能够有效控制产品质量为基本标准。如未经必要的质控分析方法验证或由拟定质控分析方法构成的制造及检定规程难以控制产品质量，则对于所申报品种的质量可控性将无法评价。本文在某些关键参数上提出一2些原则性的建议或要求，拟作为技术审评的一般原则，同时也可供申报单位在进行相关研究工作时参考。生物制品具有多样性和复杂性的特点，质控分析方法也会各有特色，所以本技术审评一般原则不可能适用于每一个生物制品。这里只提出一些基本的原则，具体的验证方案可根据这些原则制定。如进行的相关研究工作与本原则（不包括推荐的验证设计方案）不符，应提供相应的理由和依据。生物制品质控分析方法的验证工作应起始于研发工作之初，并贯穿于研发过程（包括临床前及临床研究）的始终。二、生物学测定常用方法生物学测定系指采用生物学方法，以反映被测物的生物学特性为目的的测定方法。以下为生物学测定常用方法，根据具体情况，在产品的常规质控时可采用其中的一种或几种。鉴于一种测定方法仅能反映制品某一方面的特性，且方法的变异一般较大，为更好控制产品质量，必要时需同时采用多种方法进行测定。（一）、酶反应试验是指在体外能促进酶分子的活化或本身具备酶的活性，通过底物的变化检测酶活性。主要用于酶、辅酶、激酶、激活剂、抑制剂等的活性测定。这类方法的变异相对较小，结果比较准确。（二）、结合试验是基于产品与某种物质的结合特性而设计的试验，如免疫结合试验。目前主要用于生物制品的鉴别。由于在结合试验中测定的分子3不一定都具有生物活性，所以一般不用作制品的活性（或效力）测定。这类方法的变异也相对较小。（三）、细胞测定试验是指产品可以诱导细胞产生可测定的应答，如细胞增殖、聚集、分化、死亡、迁移或产生特定的化学物质等。细胞测定试验一般能较好地反映制品的生物学活性，常用于各种生物制品的活性（效力）测定。与上述两类方法相比，这类方法的变异较大。与使用传代细胞相比，使用原代细胞的方法变异更大。（四）、动物试验是指以整体动物为试验材料检测制品生物学活性（或效力）的试验方法，如动物保护力试验，一般用于疫苗的效力测定。由于动物实验的成本高、周期长和变异大，所以一般仅用于成品检定。对于某些治疗用的制品，由于其作用机理或本身化学性质的原因，难以建立体外测活的方法，也可以采用动物试验方法测定，但由于这类方法的变异一般相对较大，在进一步的研究中应尽可能以体外法代替。三、方法的来源（种类）根据质控分析方法的来源，可将方法分为两大类，即标准方法和非标准方法。原则上，对于各类方法均需进行验证，但依方法来源的不同对于验证的要求有所不同。（一）、标准方法（或正式方法、法定方法）一般是指已有国家标准的质控方法，WHO推荐的质控方法也可作为重要参考。此类方法在被确定为标准方法前已经过了适当的验4证。申报者应说明方法的来源，并附具体方法。研制单位在首次采用此类方法前，也应对该方法进行适当的验证,如进行专属性和精密度的验证，以便证明在实际的使用条件下该方法也是适用的。（二）、非标准方法1、标准方法的替代方法此类方法系指由申报者提出的可取代标准方法的替代方法。申报者在决定采用此类方法时应持慎重的态度，并需提供表明新方法等同于或优于原方法的依据以及全面的验证资料，包括两种方法的比较性资料。2、来自参考文献的方法是指在专业杂志或著作上发表并介绍的方法，一般要认真对待此类方法，并需进行全面的验证。应说明参考文献的出处，附原文及译文。3、自己建立的方法对于某些产品，尤其是创新性产品来讲，由于缺少可参考的方法，通常需要自己建立一种新的分析方法，对于这类方法需进行全面而严格的验证。四、分析方法生物制品质控分析方法的准确性和可靠性与技术方法本身（包括方法的原理和方法的技术特点等）密切相关，所以应首先详述分析方法，包括：（一）、分析方法的原理5阐明分析方法的原理。（二）、供试品应说明如何取样，包括每次测定时取样的数量、如何取用（单支或多支混合）等。（三）、测试用仪器及参数列出所有测试用仪器及仪器的相关参数。（四）、测试用试剂列出所有测试用的试剂和规格，并说明其来源。如果某些试剂为自制或对采购的试剂进行了加工处理，则应详述制备或处理过程。（五）、标准品或参考品的配备详述标准品或参考品的来源和配备过程。标准品或参考品的来源应符合国家有关规定。（六）、供试品的配备详述待测样品的配备过程（七）、测试过程按实验步骤详述整个实验过程，说明关键步骤的实验条件。（八）、计算尽可能以表格的形式显示所获取的数据，说明数据的处理方法，提供计算公式，并说明计算方法的出处及采用依据。（九）、结果报告说明结果报告的形式（十）、判定标准6提供判定标准，说明判定标准的制定依据。五、分析方法的验证质控分析方法的验证就是根据方法的需要测定该方法的专属性、准确性、精密度、线性、范围、检测限度、定量限度、耐用性等几个指标中的一个或几个，用于不同检测目的的试验方法需进行不同参数的测定，下表为各种检测方法通常需测定的参数：杂质检查分析方法参数鉴别试验定量限度生物活性（效价）测定含量测定准确性－＋－＋＋精密度－＋－＋＋耐用性＋＋＋＋＋线性－＋－＋＋范围－＋－＋＋专属性＋＋＋＋＋检测限度－－＋－－定量限度－＋－－－注：－表示通常不需测定的参数＋表示通常需测定的参数在对不同检测方法进行验证时，可根据检测目的、方法的原理、方法的技术特点、被检物的成分等设计具体的验证方案，以下为一般性的技术要求或建议。（一）、专属性生物学测定方法的专属性与测定方法及产品组成密切相关，所以应首先从测试原理、测试用材料和供试品组成等方面分析方法的专7属性，进而再进行必要的验证。由于生物制品的性质和组成多样，检定方法各不相同，难以提出统一的专属性验证要求。下面以生物技术产品常用的几种检定方法为例，进行具体分析及说明。1、如采用免疫印迹试验进行生物制品的鉴别，应首先对所使用抗体的特异性进行分析；若供试品中还存在其它组分，则应进一步验证被检测物中其它物质能否引起非特异性免疫反应。2、如采用细胞测定方法检测生物活性，应首先说明被测物质与特定的细胞应答之间的相关性，如二者的相关性较好，则一般认为该方法的特异性较好。为表明细胞测定方法的特异性，可进行相关试验进行验证，如加入抗体或特异抑制剂的封闭实验等。如果成品中加入了可能影响活性测定的辅料，应进行相关验证以排除此种影响。3、如采用ELISA法检测重组产品的残余宿主蛋白含量，可采用与表达体系相同的宿主细胞的蛋白作为免疫原制备抗体，若采用与产品相似工艺进行处理后再免疫动物，则所获得抗体的特异性更好。另外，产品中存在的大量目的蛋白可能影响残余宿主蛋白的测定，应进行相关验证以排除此种影响。（二）、准确性对于化学药品一般可采用填加和回收实验来测定，即对已知量的供试品进行测定，比较测定值和真实值之间的差异。但对于生物制品而言，由于没有纯的标准物质，往往难以获得确切的准确性数据，所以一般不需要准确地测出该参数。8然而，仍有一些问题与生物活性测定方法的准确性密切相关，值得研究者注意。生物制品的生物学活性为相对活性，一般与同时进行测定的标准品/参考品进行比较而得，所以应对单位有一个适当的定义或以适用的标准品/参考品作为对照经计算而得。为得到准确的测定结果，应注意以下几点：1、必须同时测定供试品和标准品/参考品的剂量反应曲线，而且两条曲线必须具有平行性，即供试品和标准品/参考品的活性成分仅是量的不同而没有质的区别。如果两条曲线不具备平行性，则说明供试品和标准品/参考品中的活性成分可能不同或者该测试系统不具有适用性，这种情况下，将难以准确计算出相对活性的结果。2、应尽可能使供试品随机分布及保证测试系统的平衡性。需对引起系统偏差的某些因素进行分析排除，如不同的试验平板、平板的不同位置（如边缘效应）、检测次序、动物实验中的笼子效应等。（三）、精密度与理化测定方法相比，各种生物学测定方法的变异均较大，且不同类制品的生物学测定方法的变异也不同。对精密度的要求可根据产品的性质、用途以及测定方法的特点有所区别。在测定方法与生物活性、药理作用或效力相关性较好的情况下，应尽可能采用变异较小的测定方法。由于生物活性（或效价）测定是生物制品质控中的主要指标，该方法的可靠性会直接影响产品的可控性，所以对生物活性测定方法9的精密度验证工作应非常重视。如果在成品检定项目中生物活性指标是唯一的测定有效成分含量水平的指标，则必须采用定量的测定方法，并尽可能减少方法的变异。对于不同测定方法，其精密度可有较大不同，一般情况下，酶法：小于20%;结合试验:小于20%;细胞试验:小于30%;动物试验:小于50%。对于一些尚不成熟的试验方法或某些特殊方法（如噬斑试验），其方法变异可能会更大些。当然，对于方法精密度的可接受标准还应从多方面进行考虑。比如，有些药物的临床效应（包括疗效及不良反应）对给药剂量的变化非常敏感，这时需对生物活性测定方法的精密度提出更高的要求。（四）、线性应在分析方法的范围内评价检测结果与供试品中被分析物浓度（或含量）的线性关系。可用所建议的方法，直接对标准品、供试品进行测定。应以信号对被分析物的浓度作图，根据图形是否呈线性进行评价。如果有线性关系，可用适当的统计方法估算试验结果。在某些情况下为使分析指标和供试品浓度呈线性关系，可在回归分析前对测试数据进行数学转换。应提供相关系数、Y轴上的截距、回归线的斜率等数据，还可以分析实测值与回归线的偏差（离散性），以助于对线性作出评价。对于某些生物学测定方法，在任何转换后均不能证明呈线性，或呈线性关系的范围较小，在这种情况下，分析的响应值可用供试品中被分析物的浓度（含量）的适当函数表示。可以采用曲线拟合方法，10通过测定全范围曲线，在标准品或参考品的矫正下，依ED50或IC50值计算活性单位。应提供拟合曲线方程及各参数，并提供相关系数。（五）、范围具体的范围一般根据检测的目的而设定，并通常从线性研究中得到。验证时所设定的范围应至少包括了检定标准中规定的