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化学药品灭菌无菌工艺验证指导原则培训人：何东征部门：岳阳·研发·工艺组2015.04.培训内容ClicktoaddTitle1概述1ClicktoaddTitle2制剂湿热灭菌工艺2ClicktoaddTitle1制剂无菌生产工艺3原料药无菌生产工艺的验证24ClicktoaddTitle1小结51.概述1.1.无菌药品是指法定药品标准中列有无菌检查项目的制剂和原料药，一般包括注射剂、无菌原料药及滴眼剂等。1.2.“无菌”：一批药品的无菌特性只能通过该批药品中活微生物存在的概率低至某个可接受的水平，即无菌保证水平（SterilityAssuranceLevel,SAL）来表征，而这种概率意义上的无菌需通过合理且经过验证的灭菌工艺过程、良好的无菌保证体系以及在生产过程中执行严格的生产质量管理规范（GMP）予以保证。1.3.无菌药品的灭菌方式通常可分为：1、湿热灭菌(高压饱和蒸汽)；2、干热灭菌（干热空气）；3、辐射灭菌（Y射线）；4、气体灭菌（H2O2）；5、除菌过滤（0.22μm滤芯）。1.概述2/18/20201.概述1.4.按工艺的不同分为终端灭菌工艺（terminalsterilizingprocess）和无菌生产工艺（asepticprocessing）。1.4.1.终端灭菌工艺系指将完成最终密封的产品进行适当灭菌的工艺。1.4.2.无菌生产工艺系指在无菌环境条件下，通过无菌操作来生产无菌药品的方法1.5.终端灭菌工艺和无菌生产工艺实现产品无菌的方法有本质上的差异，从而决定了由这两类工艺生产的产品应该达到的最低无菌保证水平的巨大差异。最终灭菌产品的无菌保证水平为微生物污染概率不超过10-6，对于非终端灭菌无菌产品，应通过培养基模拟灌装证明其在95%置信限下的无菌保证水平至少应小于0.1%。由此可见，非终端灭菌无菌产品存在微生物污染的概率远远高于最终灭菌无菌产品，并且，在生产中影响非终端灭菌无菌产品的无菌保证水平的因素也相对较多，生产过程的控制难度较大，所以在选择无菌产品的灭菌方式时，应优选终端灭菌工艺。对于必须采用非终端灭菌工艺的产品，为尽量减少产品污染微生物的风险，鼓励企业在生产中采用隔离操作、吹灌封一体等先进技术。2.1.湿热灭菌工艺的研究2.制剂湿热灭菌工艺2.1.1.湿热灭菌工艺的确定依据2.1.2.过度杀灭法的工艺研究2.1.3.残存概率法的工艺研究2.2.湿热灭菌工艺的验证2.2.1.物理确认2.2.2.生物学确认2/18/20202.1湿热灭菌工艺的研究2.制剂湿热灭菌工艺2.1.1.湿热灭菌工艺的确定依据灭菌工艺的选择一般按照灭菌工艺的决策树进行，湿热灭菌工艺是决策树中首先考虑的灭菌工艺。对于药品的灭菌工艺的考察和确定，首先是考察其能否采用湿热灭菌工艺，能否耐受湿热灭菌的高温。目前湿热灭菌方法主要有两种：过度杀灭法（F0≥12）和残存概率法（F0≥8）。F0值的确认应同时满足物理学确认和生物学确认。如果F0值不能达到8，提示选择湿热灭菌工艺不合适，必须考虑其他灭菌工艺或者无菌生产工艺。在很大程度上取决于被灭菌产品的热稳定性。药物是否能耐受湿热灭菌工艺，除了与药物活性成分的化学性质相关外，还与制剂的处方、工艺、包装容器等密切相关，所以在初期的工艺设计过程中需要通过对药物热稳定性的综合分析来确定湿热灭菌工艺的可行性。需要注意的是，使用热不稳定的包装材料不能作为选择无菌工艺的唯一理由。2/18/20202.制剂湿热灭菌工艺2.1.1.1.活性成分的化学结构特点与稳定性通过对活性成分的化学结构进行分析，可以初步判断活性成分的稳定性。活性成分易氧化有针对性的进行处方工艺的优化研究在此基础之上，还应该通过设计一系列的强制降解试验对活性成分的稳定性做进一步研究确认，了解活性成分在各种条件下可能发生的降解反应，以便在处方工艺的研究中采取针对性的措施，保障产品能够采用湿热灭菌工艺2.1.1.2.处方工艺的研究采取充入惰性气体加入适宜的抗氧化剂活性成分的稳定性与pH值相关寻找最利于主成分稳定性的pH值主成分是因为某些杂质的存在影响了稳定性适宜的手段去除相关的杂质2/18/20202.1.1.3.稳定性研究无论使用何种设计方法，都需要进行最终灭菌产品的稳定性研究。考察最终灭菌程序对产品性质稳定性影响的指标可包括产品的降解量、含量、pH值、颜色、缓冲能力以及产品的其它质量特性。2.制剂湿热灭菌工艺灭菌时，杀灭微生物的效果和活性成分的降解都随着时间和温度而累积。这意味着加热和冷却的变化将影响产品的稳定性，同时影响杀灭效果。因此，稳定性研究用样品最好选取处于最苛刻的灭菌条件的产品，如：可采用在热穿透试验中F0最大的位置上灭菌的产品进行稳定性考察，以确保所有灭菌产品的质量在有效期内仍能符合要求。2/18/20202.1.2.过度杀灭法的工艺研究过度杀灭法假设的生物负荷和耐热性都高于实际数，而大多数微生物的耐热性都比较低，很少发现自然生成的微生物的D121℃值大于0.5分钟。因此，过度杀灭的灭菌程序理论上能完全杀灭微生物，从而能提供很高的无菌保证值。由于该方法已经对生物负荷及耐热性作了最坏的假设，故没有必要对每一批次的被灭菌品进行微生物的监控。2.1湿热灭菌工艺的研究2.制剂湿热灭菌工艺但这并不意味着生产过程中对微生物可以完全不加控制。即使对最终灭菌产品设定了过度杀灭参数，仍应该在适当的时间间隔内对生物负荷及耐热性进行监测。从控制热原的角度，也应当遵循工艺卫生规范，控制产品的微生物污染。如果实际生产中能够严格遵循GMP的要求，这一点是可以实现的。过度杀灭要求的热能比较大，其后果是被灭菌品降解的可能性增大。2/18/20202.1湿热灭菌工艺的研究2.制剂湿热灭菌工艺2.1.3.残存概率法的工艺研究残存概率法所需监控的指标包括被灭菌品生产开始阶段及常规生产阶段指示菌（对灭菌程序呈现强耐热性的试验菌）以及生物负荷的信息。只有对这些指标进行了有效的监控后，才能采用比过度杀灭法F0值低的热力灭菌程序，同时产品的无菌保证水平不会降低。残存概率法更适合那些处方耐热性较差的最终灭菌产品。此法能够恰当地杀灭生物负荷，同时避免产品发生不可接受的降解。此时灭菌程序的设计就需同时考虑控制待灭菌产品的生物负荷及其耐热性。无菌保证值=F0/D-lgN0其中，无菌保证值是SAL的负对数，N0为灭菌开始时产品中的污染微生物总数，D为污染微生物的耐热参数。所以，灭菌工艺的无菌保证值与F0、N0、D密切相关。2/18/20202.1.3.1.灭菌前生物负荷的控制除了需要关注灭菌过程本身，还需要在生产过程中采用一些适当的手段来监测和控制药品灭菌前的生物负荷。具体措施通常包括灭菌前微生物数量与耐热性的监测、药液过滤、工艺参数的控制等等。药液过滤：在确定工艺的过程中，也应该对滤膜的孔径、材质、滤器的使用周期进行必要的筛选。在工艺参数控制方面，由于微生物在药液放置期间也会逐渐繁殖，尤其一些营养型的注射液，如葡萄糖注射液等，其环境更有利于微生物的生长和繁殖，因此应通过工艺筛选和验证来确定溶液配制至过滤前、以及过滤后至灭菌前能够放置的最长时限，并相应确定产品的批量、生产周期等关键工艺参数。2.制剂湿热灭菌工艺2/18/20202.1.3.2.灭菌前微生物污染的监测灭菌前微生物污染水平的监测应在正常生产过程中取样并覆盖整个生产过程，取样设计应选取生产过程中污染最大，最有代表性的样品，且要充分考虑到产品从灌封到灭菌前的放置时间。一般而言，如果灌装持续一段时间，可从每批产品灌装开始、中间及结束时分别取样。污染水平检查可采用薄膜过滤法，方法应经过验证，具体操作可参照中国药典微生物限度检查法。对于最终灭菌且灭菌前生物负荷检查中发现污染菌的产品，应进行污染菌耐热性的检查。污染菌的耐热性检查可以采用合适的测定方法，比如：将样品或浸泡在药液中的收集有污染菌的滤膜，在80~100℃保温约10~30min，过滤，取滤膜培养，观察是否有菌生长。2.制剂湿热灭菌工艺耐热性检查中任何幸存下来或生长的微生物都可以被假定为耐热菌，应采用定时煮沸法将它和已知的生物指示剂的耐热性加以比较，必要时，可再进一步测试耐热污染菌的D值，然后根据灭菌的F0值及污染菌的数量与耐热性对产品的无菌做出评价。当产品微生物污染水平超标准时，应对污染菌进行鉴别、调查污染菌的来源并采用相应的纠正措施。2/18/20202.制剂湿热灭菌工艺2.2.1.物理确认2.2湿热灭菌工艺的验证物理确认所用的温度测试系统应在验证和/或试验前后校准，校准的频次应根据仪器设备的性能、验证的时间的长短来确定。温度探头的精度至少为±0.15℃。2.2.1.1.物理确认的前提物理确认所涉及的灭菌设备，也应该在验证前经过设备确认，其中应包括空载热分布试验。2/18/20202.2.1.2.装载热分布试验2.制剂湿热灭菌工艺装载热分布试验的目的是了解在装载条件下设备内部的温度分布状况，包括高温点、低温点的位置，为后续的评估和验证打下基础。装载热分布一般在空载热分布的基础上进行。温度探头的个数和安装位置取决于灭菌器的几何形状以及设备确认的结果，安装位置应包括可能的高温点、低温点，灭菌柜温度控制探头处、靠近温度记录探头处。温度探头应安放在待灭菌容器的周围，注意不能接触待灭菌的容器。装载热分布试验需要考虑最大、最小和生产过程中典型装载量情况，进行试验时，应尽可能使用待灭菌产品。如果采用类似物，应结合产品的热力学性质等(如粘度、比热容等)进行适当的风险评估。待灭菌产品的装载方式和灭菌工艺的各项参数的设定应与正常生产时一致，应采用适宜的方式（图表或照片）说明产品的装载情况，并评估探头放置是否合理。如果待灭菌产品存在不同包装规格或浓度规格，应评估验证所采用的样品和装载方式是否能充分反映所有样品的实际装载情况。每一装载量的热分布试验需要至少连续进行三次。2/18/20202.2.1.3.热穿透试验热穿透试验是考察灭菌柜和灭菌程序对待灭菌产品适用性的一项试验。热穿透试验的目的是确认产品内部也能达到预定的灭菌温度、灭菌时间或F0值。一个好的灭菌柜和灭菌程序，既要使所有待灭菌产品达到一定的F0值，以保障产品的SAL≤10－6，同时又不能使部分产品受热过度而造成药物部分降解，以致同一灭菌批次的产品出现质量不均一。热穿透试验的温度探头的个数和安装位置可参考装载热分布设置。一般采用足够数量的温度探头，将热穿透温度探头置于药液中的冷点，即整个包装中最难灭菌的位置。对于小容量注射液，如果有数据支持或有证据表明将探头放在产品包装之外也能够反映出产品的热穿透情况，风险能够充分得到控制，也可以考虑将探头放在容器之外。热穿透试验的步骤及要求与装载的热分布试验基本相同，每一装载方式的热穿透试验也需要至少进行三次。以确定达到预期的无菌保障水平对于F0值最大点位置（热点）的样品，由于其受热情况最为强烈，因此应评估该位置下产品的稳定性情况，以进一步确认灭菌对于产品的稳定性没有影响。2.制剂湿热灭菌工艺2/18/20202.制剂湿热灭菌工艺2.2.1.4.热分布和热穿透试验数据的分析处理在物理确认试验中，应确认关键和重要的操作参数并有相应的文件和记录。-保温阶段每个探头所测得温度的变化范围-保温阶段不同探头之间测得的温度变化范围-保温阶段探头测得的温度与设定温度之间的差值-保温阶段探头测得超过设定温度的最短及最长时间-F0的下限及上限-灭菌阶段结束时的最低F0值-灭菌阶段的最低和最高压力-饱和蒸汽温度和压力之间的关系-灭菌阶段腔室的最低和最高温度-热穿透温度探头之间的最大温差或F0的变化范围-热分布试验中温度探头间的最大温差-最长平衡时间-最少正常运行的探头数通常情况下，保温时间内温度波动应在±1.0℃之内，升、降温过程的温度波动可通过总体F0值来反映，如果温度或F0值差别过大，提示灭菌柜的性能不符合要求、装载方式选择不当等，需要寻找原因并进行改进，重新进行验证。对于热敏感的药物，还应该控制灭菌柜的升温和