搜索
第六章微生物学新技术在环境工程中的应用微生物学新技术遗传诱变育种基因工程酶工程微生物制剂生物表面活性剂第一节固定化酶和固定化微生物在环境工程中的应用酶是由细胞产生的能够催化生物化学反应的活性物质。酶在微生物细胞内能够发挥作用，将它提取出在体外也能发挥作用。酶制剂广泛应用于食品加工、发酵工业、印染退浆、生丝脱胶、制革、化妆品、污废水生物处理、废气生物净化等。一酶制剂剂型（一）干燥粗酶制剂将培养液除菌（或不除菌）后与淀粉等惰性填料混合、烦躁制成粗酶。（二）稀液体酶制剂将培养液过滤除去菌体杂质后直接加入稳定剂和防腐剂。（三）浓液体酶制剂将培养液过滤除去菌体杂质后浓缩，加入稳定剂和防腐剂。（四）结晶酶将酶浓缩、去杂质、纯化后在适当的温度、pH下加入铵盐或有机溶剂使其析出结晶。（五）固定化酶将酶和酶菌体固定在载体上，制成不溶于水的固态酶，可以较长时间使用。二酶的提取（一）预处理①胞外酶：将液体培养液过滤或离心除去菌体，所得的清夜即粗酶液。如果是固态发酵，用水或缓冲液浸泡，在离心或过滤除去菌体和杂质后得到粗酶液。②胞内酶：破碎细胞壁和质膜，制成无细胞提取液。（二）酶的提取由于不同的酶的等电点、pH、温度稳定性等性质不同，提取方法也不同。1水溶液提取法2表面活性剂提取法3丁醇提取法（一）浓缩葡聚糖凝胶—分子筛浓缩法、聚乙二糖浓缩法、超滤膜浓缩法、盐析或乙醇沉淀后分离。（二）去杂质pH沉淀法、利用蛋白质热变性的温度差异、蛋白沉淀剂法。（三）纯化盐析法、有机溶剂沉淀法、层析法。（四）结晶当酶达到一定纯度后，在适当的温度下、pH下，逐渐加入(NH4)2SO4溶液，酶可以慢慢析出结晶，也可以加入某些有机溶剂析出结晶。三酶的纯化１.固定化酶：从筛选、培育获得的优良菌体中提取活性极高的酶，再用包埋法（或交联法、载体结合法、逆胶束酶反应系统）等方法将酶固定在载体上，制成不溶于水的固态酶，即固定化酶。２.固定化微生物：用固定酶的方法将酶活力强的微生物固定在载体上，即成固定化微生物。微生物本身是多酶体系的固定化载体，将整个细胞固定化更有利于保持原有活性。有死细胞固定化和生长细胞固定化两种。３.固定化酶和固定化微生物特性：性能稳定、降解有机物性能强、耐毒、抗杂菌、耐冲击负荷。四固定化酶和固定化微生物水溶性酶水不溶性载体水不溶性（固定化酶）固定化技术载体结合交联法包埋法逆胶束酶固定化酶固定化技术Ⅰ载体结合法：以共价结合、离子结合和物理吸附等将酶固定在非水溶性载体上。载体有葡聚糖、活性炭、胶原、琼脂糖、多孔玻璃珠、高岭土、硅胶、氧化铝、羧甲基纤维素等。不溶性载体酶载体结合法交联法：将酶与两个以上的官能团的试剂反应形成共价键的固定方法。交联剂有：戊二醛、双重氮联苯胺和六甲撑二异氰酸酯。交联法固定化技术Ⅱ包埋法：将酶包埋在凝胶微小格子（格子型）中，或将酶包裹在半透性的聚合物膜内（微胶囊型）的固定方法。格子型的包埋材料有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、琼脂、硅胶等。微胶囊型的包埋材料有尼龙、乙基纤维素和硝酸纤维素。包埋法（微胶囊型）包埋法（格子型）固定化技术Ⅲ表面活性剂酶缓冲液逆胶束酶反应系统逆胶束酶反应系统：表面活性剂的两性分子在有机溶剂中自发形成聚集体，其亲水性一端连接成逆胶束的极性核，水分子插入核中，其疏水性的一端进入主体有机溶剂中，酶分子溶于逆胶束中，组成逆胶束酶系统。固定化技术Ⅳ第二节微生物细胞外多聚物的开发与应用微生物的胞外多聚物（Extracellularpolymers,ECP）是微生物在一定的环境条件下，在其代谢过程中分泌的、包围在微生物细胞壁外的多聚化合物。包括荚膜、粘液层及其他表面物质。这些多聚物其成分为脂、脂肽、多糖脂、中性类脂衍生物等。微生物细胞外多聚物可用作表面活性剂、絮凝剂或助凝剂、沉淀剂。生物表面活性剂和生物乳化剂是具有亲水基和疏水基结构于一体的两亲化合物。生物表面活性剂分子中具有脂肪烃链构成的非极性疏水基和有极性的亲水基，如磷酸根或多羟基基团。可以改变两相界面的物理性质，降低表面张力。生物乳化剂不能显著降低两相表面张力，但对油——水界面有很强的亲和力，能够吸附在分散的油滴表面，防止油滴聚集，从而使乳状液稳定。一生物表面活性剂和生物乳化剂的开发与应用分类产物类型生产菌1糖脂海藻糖脂节杆菌属、分枝菌属、诺卡氏菌属、棒杆菌属、红球菌属鼠李糖假单胞菌属槐糖脂Torulopsis2中性脂/脂肪酸甘油酸、脂肪酸、脂肪醇、蜡不动杆菌属、梭菌属3含氨基酸类脂脂蛋白、脂肽、脂氨基酸芽孢杆菌属、诺卡氏菌属、棒杆菌属、链霉菌属、分枝菌属、假单胞菌属、葡糖杆菌属4磷脂磷脂酰乙醇胺红球菌属、硫杆菌属5聚合物脂杂多糖、脂多糖复合物、蛋白质—多糖复合物不动杆菌属、地霉属6细胞表面本身生物破乳剂诺卡氏菌属、红球菌属肽脂不动杆菌属生物表面活性剂和生物乳化剂的分类根据单一菌种微生物(纯种)细胞表面的解离层(胞外多聚物)性质不同可以划分为两类，即疏水性的R型(菌落为粗糙型)和亲水性的S型(菌落为光滑型)。凡具有R型解离层的微生物表现疏水性而自身发生絮凝、聚集而沉降，可将R型细菌应用于废水处理中。具有S型解离层的微生物表现出亲水性，均匀分散于水中，不易絮凝和沉降。二微生物自身絮凝和沉淀作用活性污泥中的微生物可能全由R型细菌组成，也可能有R型细菌和S型细菌共同组成，或者全部由S型细菌组成，这种活性污泥是亲水性还是疏水性，取决于两者的比例和它们的表面电荷。从而导致活性污泥的吸附能力、活性污泥与水之间的表面张力的不同，进而影响活性污泥对废水中成分的吸附力和废水的处理效果。无机低分子絮凝剂无机阳离子絮凝剂：AlCl3.6H2O；Al2(SO4)3；FeCl3等。无机阴离子絮凝剂：CaO无机高分子絮凝剂：PAS、PAC、PFC、PFS化学合成类高分子絮凝剂阳离子型：PAM阴离子型：聚丙烯酸钠非离子型：聚乙烯醇天然类高分子絮凝剂：壳聚糖、藻酸钠、几丁质、纤维素、淀粉、环糊精、微生物絮凝剂无机絮凝剂有机絮凝剂三微生物絮凝剂和沉淀剂的开发与应用微生物絮凝剂是一类由微生物在生长过程中产生的可使水体中不易降解的固体悬浮颗粒、菌体细胞及胶体粒子等凝集、沉淀的特殊高分子聚合物。微生物的絮凝作用最先由法国的LouisPasteur在1876年研究酵母菌时发现的。微生物絮凝剂的优点：(1)适应范围广，具有很好的除浊脱色作用，沉降效率高。(2)可降解，其降解产物对环境无毒无害，不会产生二次污染，是一种高效安全的絮凝剂。(3)能够产生絮凝剂的微生物种类多，生长快，易于采取生物工程的手段实现产业化生产。三微生物絮凝剂放线菌、霉菌及酵母菌，乃至原生动物的一些种类细胞表面的胞外多聚物有絮凝作用。可以将有絮凝作用的微生物经扩大制成的微生物制剂直接用作絮凝剂，或者从具有絮凝作用的菌株提取其表面的有效絮凝成分做成制剂用作絮凝剂。提取微生物细胞外多聚物制取絮凝剂的方法有高速离心超声波和均化处理；酸水解、有机溶剂析出。提取步骤为：微生物浓缩和洗涤、剥取ECP、有机溶剂析出、富集和纯化。絮凝剂产生菌絮凝剂物质属性絮凝剂的组成分子量Bacillushaloalkalophilicsp.I-450酸性多聚糖中性糖(52.4%)、糖醛酸(17.2%)和氨基糖(2.4%)，中性糖包括半乳糖、果糖、葡萄糖、棉子糖2.2×106BacillusmucilaginosusMBFA9多聚糖糖醛酸(19.1%)、中性糖(47.4%)、氨基糖(2.7%)2.6×106CorynebacteriumglutamicumREA-11糖蛋白由半乳糖醛酸作为结构单元，同时含有微量的蛋白质。1×105Nannocystissp.NU-2糖蛋白由蛋白质(40.3%)和多聚糖(56.5%)组成，其中多聚糖是由葡萄糖、甘露糖、葡萄糖醛酸以5:4:1的比例组成。Bacillusfirmus酸性多聚糖由葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖以摩尔比为12.1:5.7:3.1:1的比例组成。2×106SorangiumcellulosumNUST06SC06由葡萄糖、甘露糖和葡萄糖醛酸组成,其比例约为5∶3∶1Bacilluslicheniformis谷氨酸聚合物聚谷氨酸（PGA）2×106BacillusmegateriumA25BP25多糖类物质含葡萄糖和甘露糖两种单糖，其摩尔比为4∶1，连接键型包括α-1,6糖苷键和α-1,3糖苷键1×106常见微生物絮凝剂的物质属性、组成和相对分子质量微生物絮凝剂的吸附架桥絮凝的示意图微生物絮凝剂胶体颗粒单个絮凝剂分子与胶体颗粒的结合物絮凝体架桥吸附在活性部位吸附微生物絮凝剂絮凝剂产生菌应用范围NOC-1R.ErythropolisS-1微生物细胞、活性污泥、泥浆水、河底沉积物、煤灰水、活性炭粉水等Asp.sp.JS-42微生物细胞、纤维素粉、硅胶、活性炭、氧化铝、河底污泥等Asp.SojaeAJ7002啤酒酵母、活性污泥AlcaligeneslatusB-16钢厂废水除浊、造纸厂废水脱色、油浊液除油等PF101Paecilomycessp.-1微生物细胞、红血细胞、活性污泥、纤维素粉、活性炭、硅藻土、氧化铝等MF-3SporolactobacillusGC3果汁、血细胞悬液、菌悬液、泥浆水、屠宰废水、碳素墨水、染料废水的脱色等NAT染料脱色C-62猪粪尿废水、红豆加工厂废水等部分微生物絮凝剂的主要应用领域絮凝微生物的筛选过程土壤活性污泥湖水菌制剂琼脂培养基平板菌落斜面培养基30℃培养24h接种接种液体培养基30℃摇床培养72h稀释平板法培养液高岭土悬浮液絮凝搅拌后静置静置后测定上清液的吸光值，与空白相对比，可得出絮凝率第三节优势菌种与生物制剂的开发与应用从环境中可以筛选的菌种有：①降解有毒、有害有机污染物的微生物：食酚菌，分解氰化物、苯系化合物、萘、菲、蒽、沥青等的微生物；②适应极端环境的微生物，如嗜热菌、嗜冷菌、嗜酸菌、嗜碱菌、嗜盐菌、耐压菌；③降解农药的微生物；④分解难降解污染物（如废塑料、尼龙）的微生物；⑤除臭菌。采集样品，然后用稀释平板法分离出单个菌落，进行几次平板划线纯化菌种，再将纯化的菌种接入斜面保存；进行菌种性能测定。取性能良好的菌种接斜面，于４℃冰箱保存。或真空冷冻干燥保存。制取微生物制剂时，根据废水、废物和废气的化学组分与需要量，合理搭配多种菌种。经扩大培养后用板框压滤，干燥，制成干活菌制剂。或制成浆状活菌制剂或液体活菌制剂。菌种筛选的步骤①生物膜挂膜；②废水活性污泥法处理过程的添加剂，初沉池、曝气池的投加，提高废水处理效率；③有机固体废弃物堆肥的菌种和添加剂，加速堆肥腐熟；④家庭便池、公厕的除臭剂；⑤家禽粪便处理的菌种；⑥污染严重的河道生物修复，疏浚河道底泥；⑦降解和清除海面浮油和炼油厂的废弃物；⑧土地生物修复和河床底泥的生物修复。微生物制剂的用途本章授课内容到此结束欢迎大家提出宝贵意见湖南大学环境科学与工程学院E-mail:yzh@hnu.cn