高效液相色谱法 HPLC

一、高效液相色谱法特指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。高压：150-350*105Pa高效：大于30000塔板/米高灵敏：10-9g（紫外检测）、10-11g（荧光检测）高效液相色谱法HPLC（HighPerformanceLiquidChromatography）§3-1高效液相色谱法的特点二、HPLC与GC差别1．分析对象的区别GC：适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品；但对高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品，尤其对大多数生化样品不可检测。(占有机物的20%)HPLC：适于溶解后能制成溶液的样品（包括有机介质溶液），不受样品挥发性和热稳定性的限制，对分子量大、难气化、热稳定性差的生化样品及高分子和离子型样品均可检测用途广泛。（占有机物的80%）2．流动相的区别GC：流动相为惰性，气体组分与流动相无亲合作用力，只与固定相有相互作用。HPLC：流动相为液体，流动相与组分间有亲合作用力，能提高柱的选择性、改善分离度，对分离起正向作用。且流动相种类较多，选择余地广，改变流动相极性和pH值也对分离起到调控作用，当选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相也可以增大分离选择性。3．操作条件差别GC：加温操作HPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小）1．贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物质）2．高压泵（输液泵）3．进样装置4．色谱柱——分离5．检测器——分析6．废液出口或组分收集器7．记录装置§3-2高效液相色谱仪1．高压输液系统（泵）恒压泵：在一定操作条件下，输出压力保持恒定，流量随系统压力变化而变化。恒流泵：在一定操作条件下，输出流量保持恒定，而与系统的压力无关。2．进样系统a隔膜进样（高分子有机硅胶垫→进样室）GC系统压力较小，可以HPLC系统压力太大，须停泵进样（早期）b阀进样：不必停泵，六通阀3．分离系统-色谱柱直径4~6mm,柱长10~30cm,多为不锈钢材料柱效评价：色谱系统适应性试验R，n，fs（拖尾因子）色谱柱维护预柱和预饱和柱4．检测系统1）紫外-可见吸收检测器UV-Vis：适用于吸收紫外或可见光的物质灵敏度较高，应用范围较广(光电二极管阵列检测器DAD)2）荧光检测器FLD：只能分析具有荧光活性的物质灵敏度高，但适用范围有限3）示差折光检测器RID：利用折光率的差别来检测，为通用型检测器，但灵敏度低，温度要求严格4）电化学检测器：常用的有电导检测器和安培检测器电导检测器是测量物质在流动相中电离后所引起的电导率的变化，组分浓度越高，电离产生的离子浓度越高，电导率变化就越大，多用于离子色谱。安培检测器适用于测定所有在工作电极的电压范围内发生氧化或还原反应的物质，在生化样品分析中应用广泛，是迄今最灵敏的HPLC检测器。5）其他检测器化学发光检测器、质谱检测器等5．附属系统梯度淋洗(洗脱)装置洗脱方式有：1）等度洗脱（恒组成溶剂洗脱）以固定配比的溶剂系统洗脱组分（一元泵）类似GC的等温度洗脱2）梯度洗脱：梯度淋洗指在分离过程中使流动相的组成随时间改变而改变。即不断改变溶剂极性（二元泵）适于分析极性差别较大的复杂组分类似GC的程序升温（沸程较长样品）§3-3高效液相色谱固定相和流动相高效液相色谱法有许多类型，对于不同类型的色谱方法所采用的固定相和流动相都有所差异，详细可参考§3-4各类高效液相色谱法简介一、液固吸附色谱法（LSC）二、液液分配色谱法（LLC）三、化学键合相色谱法（CBC）四、离子色谱法（IC）五、空间排阻色谱法（SEC）§3-4各类高效液相色谱法简介1．分离原理：利用组分分子占据固定相表面吸附活性中心能力的差异分离前提：K不等或k不等一、液固吸附色谱法（LSC）流动相为液体，固定相为固体吸附剂2．固定相分为极性和非极性两类极性固定相：硅胶、氧化铝和氧化镁、硅酸镁分子筛等，其中极性硅胶应用最普遍。非极性固定相：多孔微粒活性碳、多孔石墨化炭黑，以及高分子多孔微球等。1）硅胶：无定型硅胶最早使用，传质慢、柱效低薄壳型硅胶直径为30~40μm的玻璃珠表面涂布一层1~2μm厚的硅胶微粒，孔径均一、渗透性好、传质快，但柱容量有限。全多孔球型硅胶粒度一般为5~10μm，颗粒和孔径的均一性都比前两种好，柱容量大，为当今液固色谱固定相的主体，也是键合固定相的主要基质。原理-吸附特点-峰易拖尾适用-分离极性化合物2）高分子多孔小球：特点：柱选择性好，峰形好，柱效低适用：分离弱极性化合物3．流动相除了最基本的要求之外，主要考虑溶剂强度，溶解度参数及极性参数等。1．分离原理：利用组分在两相中溶解度的差异2．固定相：载体+固定液（物理或机械涂渍法）缺点是固定液层的耐溶剂冲刷性能差，固定液易流失，从而导致柱效降低，被键合相填料所取代。3．正相色谱-固定液极性流动相极性（NLLC）极性小的组分先出柱，极性大的组分后出柱，适于分离极性组分。反相色谱-固定液极性流动相极性（RLLC）极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱适于分离非极性组分。二、液液分配色谱法（LLC）键合相色谱基本上属于分配色谱，与液液分配色谱固定相不同的是“固定液”以化学键的形式与基体结合在一起的。（一）常规化学键合相利用化学反应将固定液的官能团键合在载体表面1．分离机制：分配+吸附（以LLC为基础）2．特点：不易流失热稳定性好化学性能好载样量大适于梯度洗脱三、化学键合相色谱（CPC）（二）反相键合相固定相1．分离机制：疏溶剂理论正相——流动相与溶质排斥力强，作用时间↑，k↑，组分tR↑反相——流动相与溶质排斥力弱，作用时间↓，k↓，组分tR↓2．固定相：极性小的烷基键合相C8柱，C18柱（ODS柱-HPLC约80%）3．流动相：极性大的溶剂（甲醇-水或乙腈-水）流动相极性固定相极性底剂+有机调节剂（极性调节剂）例：水+甲醇，乙腈，THF4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↓，k↑，组分tR↑5．出柱顺序：极性大的组分先出柱极性小的组分后出柱6．适用：非极性~中等极性组分（HPLC80%问题）（三）正相键合相色谱1．分离机制：溶质分子与固定相之间定向力、诱导力、或氢键力2．固定相：极性大的基团键合相（氰基或氨基键合相）3．流动相：极性小的溶剂（同LSC）底剂+有机极性调节剂例：正己烷+氯仿-甲醇，氯仿-乙醇4．流动相极性与k的关系：流动相极性↑，洗脱能力↑，k↓，组分tR↓5．出柱顺序：结构相近组分，极性小的组分先出柱极性大的组分后出柱6．适用：氰基键合相与硅胶的柱选择性相似（极性稍小）分离物质也相似。氨基键合相与硅胶性质差别大，呈碱性，分析极性大物质、糖类等。主要用于分离异构体、极性不同的化合物，特别适用分离不同类型的化合物。四、离子色谱法（IC）1.离子交换色谱凡在溶液中能够电离的物质，通常都可以用离子交换色谱法进行分离，其主要根据固定相对待测离子对的亲和力的差异来实现分离。固定相类型：强阳离子交换剂（如磺酸基）强阴离子交换剂（如季胺基）弱阳离子交换剂（如羧基）弱阴离子交换剂（如氨基）流动相以水相缓冲液为主，有时加少量有机改性剂。2.离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种分离方法。3.离子对色谱离子对色谱是一种分离离子型化合物的特殊分离模式。采用非极性固定相分离弱酸或弱碱等可离子化的物质时，因其在固定相上的保留作用很弱，不易分离。故在流动相中加一种与被分析物极性相反的离子（离子对试剂），使其与被分析物形成缔合物，从而增加保留，提高分离度。