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高效液相色谱（HPLC）主讲：郝凤霞能源化工重点实验室目录基础理论上机操作前的准备工作Agillent1100的操作常见故障排除HPLC在科研中的应用一、基础理论溶于流动相(mobilephase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相(stationaryphase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。1、色谱柱的分离原理色谱分析法的分类按两相的状态分类流动相液体流动相气体固定相固体液体固定相固体液体名称液固色谱液液色谱名称气固色谱气液色谱总称液相色谱总称气相色谱2、分离模式——键合相色谱、液液色谱、尺寸排阻色谱键合相色谱正相色谱：流动相极性固定相极性分离在水中绝对不溶解的物质或同分异构体反相色谱：流动相极性固定相极性常规分析，80％色谱图和峰参数色谱图(chromatogram)--样品流经色谱柱和检测器，所得到的信号-时间曲线，又称色谱流出曲线。基线(baseline)--经流动相冲洗，柱与流动相达到平衡后，检测器测出一段时间的流出曲线。一般应平行于时间轴。噪音(noise)--基线信号的波动。通常因电源接触不良或瞬时过载、检测器不稳定、流动相含有气泡或色谱柱被污染所致。漂移(drift)--基线随时间的缓缓变化。主要由于操作条件如电压、温度、流动相及流量的不稳定所引起，柱内的污染物或固定相不断被洗脱下来也会产生漂移。3、HPLC中的基本概念和术语色谱峰(peak)--组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线上的突起部分。正常色谱峰近似于对称形正态分布曲线（高斯Gauss曲线）。峰高(peakheight，h)-峰的最高点至峰底的距离。峰宽（peakwidth，W)-峰两侧拐点处所作两条切线与基线的两个交点间的距离。半峰宽（peakwidthathalf-height，Wh/2)-峰高一半处的峰宽。峰面积(peakarea，A)-峰与峰底所包围的面积。死时间(deadtime，t0)--不保留组分的保留时间。即流动相（溶剂）通过色谱柱的时间。保留时间(retentiontime，tR)--从进样开始到某个组分在柱后出现浓度极大值的时间。流动相的洗脱方式洗脱方式等度洗脱低压梯度高压梯度等度洗脱输液泵进样器色谱柱柱温箱检测器单一或混合溶剂梯度洗脱A泵进样器色谱柱柱温箱检测器B泵AB时间B浓度分析时间长分离度差MeOH/H2O=4/6MeOH/H2O=8/2等度洗脱95%30%MeOH浓度梯度洗脱梯度洗脱是HPLC的常用手段梯度洗脱装置流动相中含有两种或两种以上不同极性的溶剂，在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成，以调节它的极性，使样品中每个组分都有较高的分离度，从而实现各组分的圆满分离，梯度洗脱可提高柱效，缩短分析时间，改善检测器的灵敏度，它类似于气相色谱的程序升温技术。4、高效液相色谱法的应用范围高效液相色谱法适于分析沸点高、相对分子质量大，受热易分解的不稳定有机化合物、生物活性物质以及多种天然产物，这些化合物约占全部有机化合物的80%，可应用于化工生产、制药工业、食品工业、生物化工、医学临床检验和环境监测等领域。5、HPLC的系统输液泵相当于人的心脏，不断提供连续、稳定、精确的流量进样器样品引入系统色谱柱关键部分，在这里样品实现分离检测器对分离后的样品进行检测数据记录与处理装置数据分析系统输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统HPLC的系统组成Agilent1100高效液相色谱仪储液瓶真空脱气机混合室自动进样器分离柱VWD手动进样自动进样六通阀进样演示分离系统－色谱柱功能：组分分离目标：分辨力强效率高吸附剂－－－化学键和固定相色谱柱化学键合相色谱柱:70%将不同的官能团通过化学反应键和到硅胶表面的游离羟基上，而形成化学键和固定相，进而形成化学键和相色谱柱。反相:C18,65%;C8,15%;反相色谱是目前应用得最为广泛的高效液相色谱方法。正相:20%;-NH2、-CN其它(手性柱，离子交换柱):10%柱温箱控制温度，保证分析结果重现性升高温度，降低了流动相的黏度，降低柱压，保证色谱系统的稳定性升温对于反相HPLC分离强疏水肽的影响(B27)流动相:A:含0.05%三氟乙酸的水B:含0.05%三氟乙酸的乙腈2%B/min进样量:100µL(50µg的6M脲/5%乙酸)UV:210nm流速:1mL/min室温液相色谱柱:C18色谱柱尺寸:4.6x250mm5µm室温300C400C500C600C700C提高柱温，可增加柱效（提高灵敏度）检测器选择性紫外(VWD、DAD)荧光电化学通用型示差折光蒸发光散射质谱检测系统药典中的液相检测器检测器简介（一）◆紫外吸收检测器（UVD）原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型。特点：选择性检测器、波长检测范围：190-800nm；对流量和温度敏感性低、灵敏度较高（10-9g）；应用最广，对大部分有机化合物有响应；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。定量基础：Lambert-Beer定律，A＝Kbc2020/2/18光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。检测器简介（二）荧光检测器（fluorescencedetector）（FLD）原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和温度敏感性低。对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。检测器简介（三）检测器简介（四）◆蒸发光散射检测器（ELSD）原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高，是通用型检测器。检测器简介（五）◆电导检测器（ECD）原理：监测溶液的电导率变化的检测器。特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。◆示差折光指数检测器（RID）原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度的检测器。特点：通用性检测器，温变化要保持在±0.001℃、灵敏度低（10-6g）二、上机操作前，我们需要准备好什么？如：样品怎么处理？流动相怎么选？仪器参数怎么设置？1．样品的前处理最好使用流动相溶解样品。使用预处理除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。使用0.45μm的过滤膜过滤除去微粒杂质。样品准备样品完全溶解在流动相中样品没有完全溶解过滤样品，确保样品中不含固体颗粒用流动相或比流动相弱的溶剂溶解样品进样量尽量小样品过滤头的类型：30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格材料有，纤维素，醋酸纤维，聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格。处理样品体积为7μl。滤膜类型：聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：不适用于有机溶剂，特别适用于水基溶液，推荐用于蛋白质和其相关样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸，70%乙醇、二氯甲烷、不适用于二甲基甲酰胺。再生纤维素滤膜：具有蛋白吸收低，同样适用水溶性样品和有机溶剂。注意：1：每张滤膜只能用一次。2：水相和有机相不要搞混。2．流动相的配制流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中(或长时间保留在柱中)。流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应流动相的黏度要尽量小分离效果好柱压低，延长液体泵的使用寿命(可运用提高温度的方法降低流动相的黏度)流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。如使用UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。在流动相配制好后，一定要进行脱气。准备流动相1)色谱级纯或优级纯乙腈或甲醇水－－超纯水，18.2MΩ·cm过滤装置为什么要过滤？1、对色谱柱、仪器起到保护作用色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。2、消除由于污染对分析结果的影响3)溶剂准备：脱气目的流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解气体。以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法氦气脱气法：利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。在线真空脱气法：Agilent1100LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。3、流动相流速的选择具体根据色谱柱的内径选择柱子的内径（5µm填料）流速（ml/min）4.61-23.00.4-0.82.10.2-0.41.00.05-0.094、波长选择首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。5．记录时间第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。三、Agilent1100机器操作1、检查流动相Purge阀（清洗阀、排液阀）处于松开状态Purge阀逆时针打开清洗阀顺时针关闭清洗阀毛细管出口,流向进样器废液管,清洗阀打开时溶剂由此流向废液瓶.1、检查流动相Purge阀（清洗阀、排液阀）处于松开状态把流动相放入溶剂瓶中，且滤头浸入到液面下A水B甲醇C乙腈D缓冲液2、冲洗管路选择流动相为10％异丙醇＋90％水（按此比例配好溶液后存放在矿泉水瓶中）调节流速大约为1d/3s。3、打开电脑，等待TAP窗口出现4、打开1100各模块开关指示灯状态每个部件接通电源后LED灯显示绿色关机poweroff准备进样poweron没准备好NotReady运行Run故障Error驻留ResidentBlink仪器LED状态显示电源开关显示黑Black黑Black黄Yellow绿Green红Red黄闪烁Yellowblinking6种LED仪器状态：5、待1100自检完毕，双击online，启动工作站化学工作站自动与1100LC通讯，进入工作站画面。其它功能菜单文件处理运行控制仪器控制序列放弃任务在线帮助工作站任务切换快捷键方法存取快捷键序列存取快捷键运行方法运行序列面对工作站，我该怎么办？WhatshouldIdo？我们知道要运行样品需要设置控制仪器的参数，比如泵流速、流动相比例、柱温、检测器波长、样品校正等；在Agilent化学工作站中我们把仪器控制和数据分析以及仪器相关的运行等