高效液相色谱课件

高效液相色谱（HighPerformanceLiquidChromatography）基本原理高效液相色谱法原理当采用一种或多种测试方法不能直接确定混合物中特定或全部组份的组成或含量时，需要分离后再进行测定。基于混合物中各组分与流动相和固定相作用力存在差异使得它们在色谱柱中停留时间不同而完成分离。主要分离机理：分配、吸附基本原理色谱图(chromatogram)色谱峰保留时间(tR)死时间(t0)相对保留时间(tR′)峰面积(A)峰高(h)峰宽(W)T(min)S(mV)tRt0tR′Ah色谱图：是指被分离组分的检测信号随时间分布的图象。色谱峰：组分流经检测器时响应的连续信号产生的曲线，流出曲线上的突起部分。保留时间(tR)：被分离样品组分从进样开始到柱后出现该组分浓度极大值时的时间，也既从进样开始到出现某组分色谱峰的顶点时为止所经历的时间，称为此组分的保留时间，用tR表示，常以分（min）为时间单位。死时间(t0)：从进样到峰出现极大值的时间称为死时间。基本原理0选择性分离度色谱柱塔板数保留因子基本原理保留因子k=(tR–t0)/t0=tR′/t0分离因子αα=k2/k1流动相组成；色谱柱；温度色谱柱长短；流动相流量基本原理分离度考虑了保留时间和峰宽度，是一个综合指标：R1.0两峰明显重叠R=1.0两峰达97.7%分离R1.5两峰完全分开基本原理不对称度＝B/A拖尾因子＝(B+A)/2A不对称度与拖尾因子基本原理小结色谱法研究的核心：选择最适合的色谱体系和条件、在最短的时间达到最佳的分离效果。基本原理固定相重量流动相重量色谱理论1、塔板理论目的：从理论上得到描述色谱流出曲线的方程，并通过这一方程各参数来研究影响分离的因素。假设（1）色谱柱存在多级塔板;（2）组分通过时在每级塔板两相间达到一次平衡;基本原理理论塔板数N的计算基本原理相邻组分分离度的基本关系式：分离度：或基本原理1）、从理论上得到了描述色谱流出曲线的方程，通过该方程可以预测具有不同分配系数K的两种物质在塔板数为n的色谱柱上分离的情况；2）、通过这一方程看出影响柱效率的因素是理论板数n，其值越大，色谱峰越窄，分离效果越好；怎样提高色谱柱的理论塔板数n，从而提高色谱柱的效率？基本原理2、速率理论塔板理论的不足塔板理论虽然指出了理论板数n或理论板高度H对色谱柱效率的影响，但是没有指出影响塔板高度的因素，因此无法在理论指导下从实验上提高色谱柱的效率。VanDeemter方程1956年VanDeemter提出速率方程，指出了提高柱效率的途径：式中：u为流动相流动的线速度基本原理（1）A为涡流扩散项：指固定相填充不均匀引起的扩散——为填充的不规则因子dp——固定相颗粒粒径基本原理（2）B/u为纵向分子扩散项：指分子沿色谱柱轴向扩散引起的色谱谱带展宽B=2rDm式中：r——弯曲因子，填充柱r1空心柱r=1Dm——组分在流动相中的扩散系数由于组分在液相中的扩散系数只有气体中的1/105，因此在液相色谱中B可以忽略。基本原理（3）Cu——传质阻力项指组分在流动相和固定相之间传质的阻力固定相传质阻力流动相传质阻力q和为与两相的构型和性质有关的常数dp和df为固定相颗粒直径和固定液膜的厚度基本原理色谱峰展宽——涡流扩散（多通道效应）起始填充床最后A=2ldpdp粒径,l填充因子基本原理色谱峰展宽——纵向扩散B=2rDm扩散系数与温度成正比，与分子量平方根成反比，与流动相粘度成反比。基本原理色谱峰展宽——传质阻力(吸附动力学)基本原理色谱峰展宽——柱外效应柱外峰展宽进样造成色谱峰展宽Ws检测器产生的色谱峰展宽Wfs连接管内色谱峰展宽WlcW2＝Wc2＋Ws2＋Wlc2＋Wfc2基本原理综上所述，速率方程为：问题：1、怎样装柱才能使色谱柱的效率提高？2、空心柱是否能够用于色谱分离？3、如何获得色谱最佳流速？涡流扩散项纵向扩散流动相传质滞留区传质固定相内传质基本原理u在上述方程各项中存在矛盾，因此，应求出最佳值：基本原理对速率方程的讨论•选用细颗粒填料可获高柱效•流动相流速低，有利于达到高柱效•选用黏度小的流动相有利于提高柱效•温度的影响•液膜厚度的影响HPLC的应用1.与经典液相色谱法的比较：方法项目色谱柱：柱长/cm柱内径/mm固定相粒度：粒径/µm筛孔/目色谱柱入口压力/MPa色谱柱柱效/（理论塔板数/m）进样量/g分析时间/h高效液相色谱法经典液相色谱法10~252~1010~20010~505~502500~30075~600200~302~200.001~0.1~2~501~100.05~1.01~202.与气相色谱法比较方法项目高效液相色谱法气相色谱法进样方式样品制成溶液样品需加热气化或裂解流动相液体流动相可为离子型、极性、弱极性、非极性溶液，可与被分析样品产生相互作用，并能改善分离的选择性气体流动相为惰性气体，不与被分析的样品发生相互作用固定相1.分离机理：可依据吸附、分配、筛析、离子交换、亲和等多种原理进行样品分离，可供选用的固定相种类繁多。1.分离机理：依据吸附、分配两种原理进行样品分离，可供选用的固定相种类较多。2.色谱柱：固定相粒度小为5~10µm；填充柱内径为3~6mm，柱长10~25cm，柱效毛细管柱内径为0.01~0.03mm，柱长5~10m，柱效为；柱温为常温2.色谱柱：固定相粒度大0.1~0.5mm；填充柱内径为1~4mm，柱长为1~4m，柱效为；毛细管柱内径为0.1~0.3mm，柱长10~100m，柱效为；柱温为高温≈300℃检测器UVD、PDAD、FD、ECD、ELSD、RIDTCD、FID、ECD、FPD、NPD应用范围低分子量低沸点样品；高沸点、中分子、高分子有机化合物（包括非极性、极性）；离子型无机化合物；热不稳定，具有生物活性的生物分子低分子量、低沸点有机化合物；永久性气体；配合程序升温可分析高沸点有机化合物；配合裂解技术可分析高聚物HPLC的应用3.应用由于HPLC分离分析的高灵敏度、定量的准确性、适于非挥发性和热不稳定组分的分析，因此，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析，大多是通过HPLC来完成的。右图是各种HPLC方法的应用范围及对象。极性增加不溶于水溶于水非极性离子非离子极性吸附反向分配分配正向分配离子交换尺寸排阻凝胶渗透凝胶过滤分子量HPLC的应用1）优点分离效能高：柱效可达选择性高：不仅可分析不同类型有机化合物及其同分异构体，还可分析在性质上极为相似的旋光异构体，并已在高疗效的合成药物和生化药物的生产控制分析中发挥了重要作用。检测灵敏度高：比如紫外检测器最小检出量可达分析速度快：完成一个样品的分析时间仅需几分钟到几十分钟理论塔板数，荧光检测器，最小检出量可达用于痕量分析的2）局限性成本高，且易引起环境污染梯度洗脱操作复杂缺少如气相色谱法中使用的通用性检测器（如热导检测器和氢火焰离不能分析受压易分解、变形的具有生物活性的生化样品法的一种通用性检测器。子化检测器）。近年来的蒸发激光散射检测器有望成为高效液相色谱HPLC的应用高压输液系统1）贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔径约2m，可防止颗粒物进入泵内。2）脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。3）高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。输液泵种类：恒压型和恒流型。恒压泵(类似于风箱)可迅速获得高压，适于柱的匀浆填充。但因泵腔体积大，在往复推动时，会引起脉动，且输出流量随色谱系统阻力（主要是柱填充物）变化而变化，现已较少使用。恒流型溶剂流量恒定，与柱填充情况无关，使用较多。有机械注射式和机械往复式两种。应用最多的是机械往复式恒流泵(见下图。每分钟往复25~100次，因此脉动小。对流量变化敏感的检测器也会有噪声干扰，此时可连接一脉动阻尼器)。HPLC的应用马达往复式拉动密封溶剂球阀脉动阻尼器到色谱柱机械往复柱塞泵示意图4）梯度淋洗装置：在分离过程中逐渐改变流动相组成的装置。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。高压输液系统HPLC的应用高压输液系统缺点：检测器的使用受到限制，分析结果的重复性取决于流速的稳定性。柱子需进行再生处理。梯度洗脱优点：分离复杂混合物，使所有组分都处在最佳的k值范围内。HPLC的应用进样系统与GC相比，HPLC柱要短得多，因此由于柱本身所产生的峰形展宽相对要小些。即，HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。1）隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。2）高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。装入样品出口进样采样环泵入溶剂进色谱柱HPLC的应用分离系统1）对色谱柱的要求：内壁光滑的优质不锈钢柱，柱接头的死体积尽可能小。柱长多为15~30cm，内径为4~5mm(尺寸排阻色谱柱常大于5mm，制备色谱柱内径更大)；2）柱的填充：主要采用匀浆法。根据使用匀浆试剂的性质不同可分为：平衡密度法：即使溶剂密度和填充颗粒密度相近，此时颗粒沉降速度趋于0。常用的匀浆试剂有四氯乙烯、四溴乙烷和二碘甲烷等；非平衡密度法：当采用粘度较大的试剂，如CCl4，CH3OH,丙酮，二氧杂环已烷、THF等。填充方法：填充时，按上述方法制作匀浆液，用流动相充满色谱柱及其延长管中，然后将匀浆液倒入匀浆填充器，在较高压力下迅速将其注入色谱柱内。要求填充速度快(防凝聚、沉降或结块)、且无空气进入(影响填充均匀性)。HPLC的应用分离系统包括柱管与固定相两部分一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm凝胶色谱柱内径3～12mm微柱内径1-2mm，长1-5cm制备往内径较大，可达25mm以上HPLC的应用检测系统紫外检测器其检测原理和UV-Vis方法一样。只是，此时所采用的吸收池为微量吸收池，通常其光程为2-10mm,体积约为1~10L。HPLC分析中，约有80%的物质可以在254nm或280nm处产生紫外吸收。因此该类检测器应用很广。在选择测量波长时注意：溶剂必须能让所选择的光透过，即所选波长不能小于溶剂的最低使用波长。HPLC的应用检测系统响应特性选择性检测器，如芳烃类化合物的检测灵敏度高，可检测10-9g/mL的物质线性范围宽，104-105对温度及流动相的改变不敏感适合梯度洗提HPLC常规检测器HPLC的应用检测系统示差折光检测器光源调零光学零参比样品平面镜透镜光电转换记录仪放大器遮光板利用两束相同角度的光照射溶剂相和样品+溶剂相，利用二者对光的折射率不同，其中一束（通常是通过样品+溶剂相）光因为发生偏转造成两束光的强度差发生变化，将此差示信号放大并记录，该信号代表样品的浓度。为通用型检测器，灵敏度为10-7g/mL。但对温度变化敏感，且不适于梯度淋洗。HPLC的应用检测系统荧光检测器利用某些溶质在受紫外光激发后，能发射可见光(荧光)的性质来进行检测的，是一种高灵敏度和高选择性的检测器。对不产生荧光的物质，可使其于与荧光试剂反应，制成可发生荧光的衍生物再进行测定。荧光检测器是一种选择性很强的检测器，其灵敏度比UV检测器高2~3个数量级。HPLC的应用检测系统安培检测器由恒电位仪和一薄层反应池（体积为1~5L）组成。该检测器是利用待测物流入反应池时在工作电极表面发生氧化或还原反应，两电极间就有电流通过，此电流大小与待测物浓度成正比。采用安培检测器时，流动相必须含有电解质，且呈化学隋性。它最适于与反相色谱匹配。但此检测器只能检测具有电活性的物质。接参比电极和对电极接色谱柱Teflon塑料块1cm工作电极(Pt,Au,碳糊)HPLC的应用检测系统几种检测器特