荧光定量PCR的原理及其应用

荧光定量PCR的原理及其应用蒋昌龙荧光定量PCROutline•荧光定量PCR的原理•荧光定量PCR应用PCR反应过程5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers反应组分变性延伸5’3’5’3’3’5’3’TaqTaq重复退火5’3’3’3’3’5’3’3’5’3’3’循环24个拷贝循环38个拷贝3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’5’3’3’Cycle#TheoreticalRealLifeLogTargetDNAPCR反应模式同一样品96复孔的实验结果荧光定量PCR原理缺憾无法对初始模板精确定量无法实时监测扩增情况跑胶繁琐、易污染常规PCR电泳鉴定荧光定量PCR在体系中引入荧光染料实时检测扩增阶段：指数期平台期荧光定量PCR原理荧光定量PCR原理ThresholdlineC(t)value阈值：荧光扩增曲线指数增长期设定的一个荧光强度标准C(t)值：荧光信号到达阈值时所经过的扩增循环次数荧光定量PCR原理X=X0(1+Ex)nlogX=logX0(1+Ex)nlogX0=(-log(1+Ex))*n+logXlogX0=(-log(1+Ex))*C(t)+logXc(t)n：扩增反应的循环次数X：第n次循环后的产物量X0：初始模板量Ex：扩增效率初始模板的Log10值与Ct值呈线性关系！设定标准品，绘制标准曲线荧光定量PCR原理荧光强度---循环数曲线初始模板量对数---C(T)循环数标准曲线10410310610510210unknown104103Ct值通过标准曲线对未知样品模板进行准确定量荧光定量PCR原理荧光定量PCR原理两种定量方法•绝对定量标准曲线法•相对定量双标准曲线法2-ΔΔc(t)法荧光定量PCR原理•精确定量•大范围拷贝数样品同时检测–100—1010•省时有效通过浓度梯度标准品，绘制标准曲线样品结果与标准曲线比对得到精确的浓度临床检测，转基因检测，环境监测等绝对定量荧光定量PCR原理设置内标：b-actin、GAPDH等管家基因对靶基因进行均一化：靶基因拷贝／每一个内标基因拷贝双标准曲线法含靶基因与含内标基因的浓度梯度质粒分别做标准曲线；样本靶基因与内标基因绝对浓度的换算，并均一化处理；标本间靶基因的表达水平分析2-ΔΔc(t)法标本内靶基因与内标基因Ct值比较：ΔC(t)=C(t)m－C(t)n标本间ΔC(t)比较：ΔΔc(t)＝ΔC(t)1－ΔC(t)22-ΔΔc(t)计算相对定量无需制备标准品(2-ΔΔc(t)法)，需要内参照基因，注意扩增效率(内参与目的基因扩增效率相近）差异表达分析，芯片结果验证等相对定量荧光定量PCR原理•插入染料法SYBRGreenI•杂交探针法TaqMan荧光定量PCR原理5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers反应组分变性插入染料方法的原理SYBRGreenITaqIDl延伸5’3’5’3’检测激发的荧光5’3’5’3’TaqTaq3’5’3’TaqTaq退火IDIDIDIDIDIDIDIDIDIDlllll插入染料法相对成本低不需要设计探针，通用性强对引物的设计要求较高（注意非特异性扩增）不能做多重PCRMeltingCurveanalysis•逐步提高温度，读取荧光值，得到温度与荧光值的关系曲线温度荧光强度TmTm值：一半DNA解链时的温度-dIdTTmSolvethenon-specificproductMeltingcurve优化条件更换引物权宜之计95℃10sec60℃15sec72℃30sec80℃10secdetection40cycles杂交探针方法•TaqMan探针•分子信标探针（MolecularBeacons）荧光定量PCR原理TaqMan探针5’5’3’3’d.NTPsTaq酶Primers反应体系变性TaqlRQProbeRQ5’3’RQ退火5’3’1.链取代TaqQR5’3’QTaqR5’2.水解3.聚合5’3’TaqR5’4.检测荧光5’3’TaqR5’l扩增特异性强可以做多重检测成本较高MolecularBeacon发夹结构退火时与靶片段结合引物延伸时被切断More…•医疗领域的应用•科学研究方面的应用•公安系统内的应用•动植物检疫•考古学方面的应用•……荧光定量PCR应用医疗方面的部分应用（1）：临床检测：疾病的临床早期诊断如各种肝炎、性病、遗传性疾病、与优生优育相关的疾病以及肺结核等等疗效考评指导制订感染性疾病合理治疗方案了解感染性疾病病人用药后病情的变化情况医院、血站及防疫站的确诊荧光定量PCR应用医疗方面的部分应用（2）：遗传病诊断：等位基因检测多基因遗传病的突变检测基因表达异常所致遗传病检测荧光定量PCR应用医疗方面的部分应用（3）：肿瘤诊断：肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因肿瘤标志物如癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等肿瘤耐药基因（MDR）荧光定量PCR应用研究方面的部分应用（1）：分子生物学方面：研究各种处理对细胞mRNA含量变化的影响比较染病组织与正常组织中各种mRNA含量差异DNA或RNA的转染量与实验结果关系的研究荧光定量PCR应用研究方面的部分应用（2）：植物学方面：转基因植物中基因拷贝数与性状的关系监测转基因植物中基因拷贝数的变化转基因植株早期的筛选监测农作物病虫害抗药性变化荧光定量PCR应用研究方面的部分应用（3）：动物学方面：动物疫情监测新的防止疫情发生及控制的药物及方法的研究转基因动物中目的基因拷贝数与品质的关系研究及早期筛选荧光定量PCR应用其他方面的部分应用（1）：进出口检验相关：动物检疫，如各种动物流行病植物检疫，如各种植物流行病有害动物，特别是昆虫食品检测，如各种有害病原微生物，如病毒、细菌、支原体转基因植物检验，如转基因大豆、西红柿等荧光定量PCR应用其他方面的部分应用（2）：公安系统相关：个人身份鉴定物证的各种鉴定人种的鉴定考古方面物种分类荧光定量PCR应用据统计，目前中国有10~15%的人感染有HBV病毒人工受精前男性HBV检测患者血清、精液的HBV检测荧光定量PCR应用乙肝病毒HBV检测检测方法荧光定量PCR应用患者血清、精液DNA的提取酚/氯仿、试剂盒抽提50°C5min95°C10min95°C15sec60°C40sec40cyclesTaqManProbe0.25uMPrimer0.9uMPCRbuffer1хTemplate50~200ng扩增HBV核心抗原core基因含coregene不同浓度梯度质粒为标准品统计分析荧光定量PCR应用检测结果Amplificationofstandards特异性强：使用了Taqmanprobe灵敏：检测下限达到了10copies，荧光定量PCR应用检测结果血清中HBV含量比精液中高出两个数量级使用TaqMan探针进行双通道荧光定量Fam标记目标基因探针VIC标记看家基因探针荧光定量PCR应用ERBB2的表达（正常组织vs.肿瘤组织）目标基因：ERBB2oncogene看家基因：GAPDH模板从正常乳腺组织中提取的TotalRNA从乳腺癌组织中提取的TotalRNA含ERBB2andGAPDH的质粒用于生成标准曲线荧光定量PCR应用荧光定量PCR应用荧光定量PCR应用ERBB2扩增曲线PMT1-FAMdetection-ERBB2PMT2-VICdetection-GAPDH荧光定量PCR应用HealthyRNATumorRNAGAPDHERBB210951052213024929550085730136000130800Copiesng/µlTotalRNA荧光定量PCR应用ERBB2copies/GAPDHcopies1095/95500=0.0111052/85730=0.0122130/136000=0.0172492/130800=0.019HealthyRNATumorRNA0.01150.0180.011/0.018GraphCopiesng/µlTotalRNA荧光定量PCR应用00.20.40.60.811.21.41.61.82HealthyTissueCarc.TissueRelativeExpressionERBB2的表达差异荧光定量PCR应用荧光定量PCR应用胃癌早期诊断之SOCS-1高甲基化的检测肿瘤抑制基因高甲基化而引起基因沉默是胃肿瘤发生的一个重要机制甲基化一般发生在基因的启动子区CpG中的C核苷酸SOCS-1(suppressorofcytokinesignaling-1)高甲基化与胃肿瘤的发生具有密切联系荧光定量PCR应用研究方法胃癌患者血清DNA提取（蛋白酶K、SDS、酚/氯仿、乙醇）亚硫酸氢钠处理DNAtemplateSYBRsupermixPrimers定量PCR体系以InvitromethylatedDNA(IVD)为阳性对照（标准品）以非甲基化的胃癌细胞系KATOIII为阴性对照以6个年龄、性别匹配的正常人血清做统计学分析•修饰非甲基化CpG为UpG•甲基化位点不修饰针对未经修饰改变的启动子序列荧光定量PCR应用研究方法亚硫酸氢钠处理的血清DNA94°C6min94°C10sec64°C25sec72°C25sec77°C10secMeltingcurveanalysis40cycles定量PCR(SYBR)结果统计、临床意义分析荧光定量PCR应用研究结果MeltcurveofrealtimeMSPanalysisofSOCS-1geneThestandardcurveof(invitromethylatedDNA,IVD)determinedat77°C荧光定量PCR应用研究结果aInvitromethylatedDNAbResultsfromduplicateexperimentcAmountofmethylatedSOCS-1asdeterminedbyCtvalue荧光定量PCR应用癌症患者血清中SOCS-1高度甲基化此方法诊断具有非侵入人体优点SOCS-1可作为胃癌早期诊断的指标之一•基因表达水平研究–基因的绝对表达量（微生物检测、环境监测）–标本间基因的差异表达（病理相关、芯片验证）•基因型研究–基因单碱基变化（SNP、mutant）–基因的碱基修饰（甲基化等）荧光定量PCR应用More…Weneedtodecidewhattostart?•决定实验方案（绝对定量？相对定量？）实验目的•决定选用实验方法(SYBRgreen？TaqMan?)检测基因数、样本数成本核算WeneedKits?定量PCR试剂•SYBRGreenIMix•TaqManMix配套耗材•Tubes•Strips•[e-mail]